第七章酶工程制药精要.ppt

4、酶和细胞的固定化载体 在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物为载体或基质。固定化载体必须符合一定的条件： ①固定化过程不引起酶变性； ②对酸碱有一定的耐受性； ③有一定的机械强度； ④有一定的饿亲水性及良好的稳定性； ⑤有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； ⑥共价结合时具有可活化基团； ⑦有耐受酶和微生物细胞的能力； ⑧廉价易得。 酶和细胞固定化的载体见书中表7-1 吸附载体，主要有物理吸附和离子吸附两种，物理吸附有无机物和有机物。 包埋载体，目前工业上用的包埋载体主要有卡拉胶、海藻胶等。 共价结合载体，有纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。 交联法是通过双或多功能试剂进行固定化，因此不需要固定化载体。也可用与吸附法和包埋法相同的载体进行交联。 5、固定化酶的制备技术 （1）吸附法制备固定化酶技术 物理吸附——用酶的水溶液与对此酶具有高度吸附能力的载体混合——洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶（易脱落，故不常用） 离子交换吸附——处理方法与物理吸附相同，但离子间力强（较常用） （2）包埋法制备固定化酶技术 凝胶包埋法和微囊化包埋法： 凝胶包埋法——将酶或细胞限制于高聚物网格中的技术；可以通过调节凝胶材料的浓度来改变包埋率和固定化酶的机械强度。还可通过先包埋再交联的方法，使保留更坚固。 微囊化法——将酶或细胞固定于不同构型的膜的外壳内的技术。包有酶的半透膜厚约20nm，膜孔径40nm，有界面沉降法和界面聚合法两种。 ① 界面沉降法是物理法，其利用某些在水相和有机相界面上溶解度极低的高聚物成膜的过程将酶包埋的方法。其过程为 酶溶液在表面活性剂帮助下与水不混溶的沸点比水低的有机相中乳化——将溶于有机溶剂的高聚物加入搅拌下的乳化液中——加入另一种不能溶解高聚物的有机溶剂——使高聚物在油水界面上沉淀、析出及成膜——最后在乳化剂作用下使微囊从有机相中转移至水相，即成固定化酶。 ②界面聚合法是化学法，其利用不溶于水的高聚物单体在油-水界面上聚合成膜的过程制备微囊。成膜的高聚物有尼龙、聚酰胺及聚脲等。见下例： 含酶的10%血红蛋白溶液 己甲叉二胺水溶液 + 混合液1 含1%Span85的氯仿-环己烷 + 混合液2 溶于有机相的癸二酰氯 + Tween20去乳化，转移至水相 微囊 （3）交联法制备固定化酶技术 主要是多功能试剂的使用。 交联酶法：主要是通过多功能试剂使酶分子间形成网络结构而固定化 酶-辅助蛋白交联法：是指向酶溶液中加入辅助蛋白的交联过程，酶活回收率和机械强度较交联酶法高。 吸附交联法：吸附与交联相结合的方法 载体交联法：利用多功能试剂分子的一些化学基团与载体偶联而另一些化学基团与酶分子偶联的方法。 （4）共价结合法制备固定化酶技术 共价结合法是通过酶分子的非活性基团与载体表面的活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接法。 共价结合法反应条件剧烈，常导致酶活下降或失活，成本因失败几率高或效率的低下而变得不太实用，因此在医药工业中应用较少。 二、固定化细胞的制备 1、固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。 固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系，它的应用比固定化酶更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶绿体及微粒体等细胞器的固定化。 2、固定化细胞的特点 生物细胞虽属固相催化剂，但因其颗粒小、难于截流或定位，也需固定化。固定化细胞既有细胞特性，也有生物催化功能，又具有固相催化剂特点。其优点在于： ①无需进行酶的分离纯化； ②细胞保持酶的原始状态，故酶活回收率高； ③细胞内酶比固定化酶稳定性更高； ④细胞内酶的辅因子可以自动再生； ⑤细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应； ⑥抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 固定化酶主要适用于细胞内酶，底物和产物易于透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其它副反应，若有副反应应有相应消除措施。 固定化细胞技术主要有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法。这些技术与前面提到的相关固定化酶的技术类似。 三、固定化方法与载体的选择依据 1、固定化方法的选择 （1）固定化酶应用的安全性：主要是指固定化过程中应用的试剂是否有毒性和残留。 （2）固定化酶在操作中的稳定性：主要从酶活和稳定性方面考虑，选择折中的条件。 （3）固定化的成本：应尽可能降低成本。 2、载体选择 一般是为了工业化生产，因此性能好、价格便宜是一项重要的指标；此外，底物或产物性质都是重要的考虑对象。见书P227中表7-2。 四、固定化酶的形状与性质 目前已有多种物理形状的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纤维、微囊和颗粒状的固定化酶。 固定化酶的物理形状不仅是为了适应不同的应用目的