第三章DNA复制精要.ppt

3 DNA复制 3.1 DNA复制的基本原则 3.2 DNA复制的方式 3.3 DNA复制的酶类体系 3.4 DNA复制过程 3.5 端粒和端粒酶 3.1 DNA复制的基本原则 3.1.2 DNA复制的半不连续性 1968年，日本学者冈崎等用3H-脱氧胸苷标记的噬菌体T4感染大肠杆菌，再通过CsCl密度梯度离心分离出标记的DNA产物，发现先合成的是1000个核苷酸长度的片段。 说明DNA复制中先合成较短片段，再由连接酶连成大分子DNA DNA复制是以半不连续方式进行，一条链的合成按5′→3′方向连续合成，其合成方向与复制叉的移动方向一致，称为前导链（Leading strand），另一条链的DNA合成是在复制叉打开到一定程度后才开始的，先合成许多不连续的小片段（冈崎片段，Okazaki fragment ），最后合成一条完整的DNA链，称为后滞链（Lagging strand）。 3.1.3 DNA复制的引物 DNA的合成需要引物，RNA的合成不需要引物。 实验证据来自M13噬菌体DNA在大肠杆菌细胞中的复制过程被利福平（Rifampicin）抑制的实验。 目的：保持DNA复制的高度忠实性。 原因：DNA聚合酶具有校正活性，而RNA聚合酶没有校正功能。在低保真引物完成功能后将其删除，而代之以DNA聚合酶Ⅰ指导合成的高保真DNA链。 结果：使DNA复制的准确性提高了105倍。 3.1.4 DNA的双向复制 大多数真核和原核生物的DNA都进行双向复制，即复制时两个复制叉从复制起点开始，同时向两个方向推进。当然也存在单向复制，即仅有一个复制叉运动，而另一个复制叉一直停留在复制的起点。 Gyurasits和Wake通过对枯草杆菌DNA复制的放射自显影实验揭示了DNA的双向复制机制 3.2 DNA复制的方式 DNA中发生一次复制的单位称为复制子（Replicon）。 原核基因组中只含有一个环状的复制子，在唯一起始点启动会引发整个基因组的复制。大肠杆菌基因组从唯一的起始点OriC开始进行双向复制，形成的两个复制叉基本以相同速度推进，其复制终点在OriC正对面近乎180o处。 真核细胞中的每条染色体的复制均是通过多个复制子完成的，通常也是进行双向复制，相邻复制叉相遇后发生融合，因此不存在明显的终止位点。 3.2.2 滚环复制 有些环状DNA以滚环模式复制，即双链中的一条链产生一个缺口，DNA聚合酶从缺口上的3′端开始，以另一条完整链为模板进行链的延伸，这样新合成的链将替代原来的亲本链，好象模板环在不断滚动。（图3-7A ） 图3-7B：噬菌体ΦΧ174的单链DNA首先形成双链的复制型（Replicative form），在DNA正链的复制起始点上进行单链切断，5′端与A蛋白相连，DNA聚合酶Ⅲ以未切断的负链为模板，从正链的3′端开始不断延伸进行复制，5′端却不断地脱离环状模板被剥离出来，成为越来越长的游离单链。当复制回到起始点时，具有内切酶活性的A蛋白切割起始点并结合于新的5′端，被替代的正链以环状形式释放。 3.2.3 D环复制 线粒体和叶绿体的双链环状DNA从特殊位点开始解链，但两条亲代链中只有一条作为模板（H链）合成新链，开始复制出一小段DNA，取代了原来的互补链（L链），这样一条单链和一条双链组成的结构，称为置换环（Displacement loop）或D环。随着复制的继续进行，D环不断扩大，L链被不断置换，直至L链上的起始位点暴露，开始新的H链的合成。因此双链DNA的两条链分别有自己不同的Ori。 3.3 DNA复制的酶类体系 表3-1 大肠杆菌DNA聚合酶的比较 DNA聚合酶Ⅰ主要作用是在DNA复制的过程中负责清除RNA引物，该功能依赖于其5′→ 3′外切酶活性。 DNA聚合酶Ⅰ的“缺口平移”过程可用于制备放射性标记核酸探针。 DNA聚合酶Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段称为Klenow片段，失去了原来的5′→3′外切酶活性。 DNA聚合酶Ⅲ至少包含10个亚基。 α、ε、θ三个亚基构成的催化核心，α亚基具有5′→3′聚合酶活性，ε亚基具有3′→5′外切酶活性，θ亚基负责激活外切酶活性。 两个β亚基形成“夹钳”（Clamp），套在DNA模板上，在复制时沿着模板滑动，防止聚合酶从DNA上脱离。 二聚化亚基τ使两个催化核心连接在一起。 由γ2δδ′χψ组成的γ复合体作为夹钳装载机（Clamp loader），负责将β亚基结合到DNA上。 因此，DNA聚合酶Ⅲ是一个不对称的二聚体，每个单体都具有一个催化核心、一个二聚化亚基、一个具有前进能力的亚基，能同时催化两条DNA链的合成 3.3.1.3 单链结合蛋白 （Single-strand binding protein, SSB） 单链结合蛋白结合并