第三章二维电泳的蛋白质提取与样品制备精要.ppt

第三章 二维电泳的蛋白质提取与样品制备 制备目的 完全溶解 解离 变性 还原蛋白 选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去污剂和裂解液的成分 样品制备原则 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解 样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿反复冻融已制备好的样品 通过超速离心清除所有的杂质 加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白 第一节细胞裂解方法 温和裂解方法 剧烈裂解方法 用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白沉淀步骤 清除影响二维电泳图谱杂质 裂解液组分 一、温和裂解法 组成较简单样品 渗透裂解 血细胞、组织培养细胞 低渗溶液悬浮细胞 冻融裂解 细菌、组织培养细胞 液氮迅速冷冻细胞，随后在37 ℃融化，反复几次 去污剂裂解 组织细胞 溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物 酶裂解法 消化细胞壁 溶菌酶 细菌 纤维素酶、果胶酶 植物 溶细胞酶 酵母 在等渗溶液中处理细胞 二、剧烈裂解法 超声裂解法 细胞样品 通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却 弗氏压碎器（French Pressure cell） 含有细胞壁的微生物 在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力 研磨法 固体组织、微生物 冻存于液氮中，随后研磨成粉末 机械匀浆法 固体组织 将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液 玻璃珠匀浆法 细胞悬液、微生物 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁 三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail） 苯甲基磺酰氟 (Pheylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L?，抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中迅速失活 AEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L?，AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点 EDTA，EGTA：使用浓度为1mmol/L，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。 多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml ? 亮抑酶肽（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基多肽酶 甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCk），甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPC）K：使用浓度为0.1-0.5mmol/L?，不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶 苄脒（Benzamidine）：使用浓度为1-3mmol/L?，抑制丝氨酸蛋白酶 四、蛋白沉淀步骤 1、硫酸铵沉淀（盐析） 原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中 步骤：蛋白浓度大于1mg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L，并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10~30min，通过离心沉淀蛋白 只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等电聚焦 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用 2、三氯醋酸（TCA）沉淀 原理 ① 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐② 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团, 使之聚集沉淀 2、三氯醋酸（TCA）沉淀 原理 ③ 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显 ④ 电泳图谱显示，BSA 、HSA 单体谱带有较明显的展宽现象，这可能是由于TCA 的结合，使SDS 与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致 2、三氯醋酸（TCA）沉淀 有效的沉淀方法：将TCA加到提取液中，终浓度高达10~20%，冰上沉淀30min；组织样可直接用10~20%TCA进行匀浆；最后用丙酮清洗沉淀，以除去TCA 蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶 3、丙酮沉淀 沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出 优点： 分辨能力比盐析法高， 沉淀不用脱盐，过滤较为容易 在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性 4、在丙酮中用TCA沉淀 两者联合更加有效 10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有0.01%β-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT)，至少-20℃沉淀45min 仍然存在难再溶