第三章免疫原和抗体的制备精要.ppt

第三章免疫原和抗体的制备 概要 第一代抗体：多克隆抗体 第二代抗体：单克隆抗体 第三代抗体：基因工程抗体 第一部分　多克隆抗体制备 　英文全称：polyclonal antibody,PcAb 定义：它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的抗体，是多种抗体的混合物。 如何制备？是通过给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清。 一、免疫原的制备 乳化方式： 研磨法： 易乳化，但抗原或佐剂用量大。 搅拌混合法： 无菌操作，节省抗原或佐剂，但不易乳化完全。 三、免疫动物 三、免疫动物 2.免疫途径 3.免疫时间 四、试血 举例：抗人白蛋白的制备 1、抗原的准备： 分别抽取数人全血，分离血清并混匀； 分离制备白蛋白(请问可用哪些方法？) 2、佐剂的准备： 福氏不完全佐剂：称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml高压灭菌后4℃保存备用。 福氏完全佐剂：于不完全佐剂中加入2~20mg/ml卡介苗，研钵中钵磨乳化后即成为完全佐剂，冰箱保存备用。 3、抗原-福氏完全佐剂的制备： 取混合人全血清，用生理盐水作1：4稀释。将稀释血清与完全佐剂1：1体积的比例混合，制成油包水状态。 研磨法： 取完全佐剂置无菌和研钵中，然后逐滴加入稀释混合人血清，边加边研磨，直至滴一滴至水中不散开为此，此即完全乳化的油包水状态。 4、动物选择： 健康成年家兔，雄性，体重2-3kg。 5、动物免疫： 第一次：两后足掌分别注射抗原－福氏完全佐剂0.5ml。 第二次：第14天 在双后腿窝或蹊部可摸到肿大淋巴结，在每侧肿大淋巴结中各注射0.5ml。 6、试血： 第21-24天，从耳静脉采血0.5-1ml，分离血清，测效价达 1：16以上即可收集血清。如效价不高，可追加免疫。 7、加强免疫： 耳静脉注射人血清0.5ml左右以加强免疫，一周后再免疫，如此重复一两次，并于最后一次注射一周后采血测效价。 8、抗血清采集： 颈动脉放血（也可心脏采血）获得的兔血，置37℃促进血块收缩，并吸出血清。 9、抗血清的鉴定： 获得的免疫血清需要进行特异性检测、亲和力检测和效价滴定。 10、抗血清的纯化： 11、抗血清的保存： 抗体以20~30mg/ml浓度为宜，加入万分之一的硫柳汞或千分之的叠氮钠防腐，并加入等量的中性甘油，分装小瓶，-20℃以下保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。 。 混合 1~5:1 作用大于不完全佐剂;局部形成肉芽种和溃疡;不能用于人体 弗氏完全佐剂 3.弗氏佐剂(Freund adjuvant) 液体石蜡 ＋ 弗氏不完全佐剂 卡介苗 终浓度2～20mg/ml 羊毛脂 抗原 抗原 1:1 1:1 完全乳化 鉴定 一滴乳剂 乳剂不散浮于液面 水中 4.脂质体 　其与抗原合用，可更有效地激发机体的免疫功能，增强免疫反应。IL－2、IL－1、IFN等都是良好的佐剂。 　包封抗原后，可使抗原延缓释放，并且脂质体有刺激机体免疫反应的作用。 5.细胞因子 1.改变抗原的物理性状，使抗原在体内滞留或延缓释放，延长抗原与免疫细胞作用的时间，从而增强抗原免疫原性。 2.抗原在佐剂的辅助作用下，更易被巨噬细胞有效吞噬和有效的加工处理和呈递。 3.刺激单核－巨噬细胞活化，释放细胞因子调节和增强淋巴细胞的应答能力。 4.刺激淋巴细胞增生分化，从而增强和扩大免疫应答能力。 应用佐剂的缺点 ① 佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性； ② 注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿； ③ 反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。 一）、动物的选择 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好； 2.动物个体选择: 适龄、健壮、无感染正常动物、体重合乎要求； 3.抗原性质:酶类—豚鼠；甾体激素—家兔　 4.血清用途: R型:等价带宽,适于诊断试剂.用家兔免疫产生. H型:等价带窄,适于免疫治疗.用马免疫产生. 5.抗血清需要量选择: 二）、免疫方法 1.免疫剂量： 1)不能过大或过小，否则产生免疫耐受； 2)首次免疫剂量不宜过大 3)大:0.5-1mg/只 小:0.1-0.6mg/只 2.免疫途径： 3.免疫间隔时间：　 1）.皮内或皮下注射： a.采用多点注射(8-10点)； 　b.半抗原宜皮内多点