第三章动物细胞工程制药精要.ppt

第一节 动物细胞的形态和生理特点 一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类：贴壁细胞和 悬浮细胞。 ⒈贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型和 上皮细胞型 ⒉悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 ⒊兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。 二、动物细胞的生理特点 ⒈细胞的分裂周期长 ⒉细胞生长需贴附于基质,并有接 触抑制现象。 ⒊正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。 ⒋动物细胞对周围环境十分 敏感; ⒌动物细胞对培养基要求高 ⒍动物细胞蛋白质的合成途径和修饰 功能与细菌不同。 第二节生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系 融合细胞系 二、生产用动物细胞的获得 ⒈原代细胞 是直接取自动物组织器官，经过粉碎消化而获得的细胞悬液（109/g），需要大量动物，费钱费劳力。 例如：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞。 ⒉二倍体细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分的组织中，挑选并纯化出某种具有一定特征 的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点： ①染色体组型是2n核型； ②贴壁依赖接触抑制； ③可传代培养50代； ④无致瘤性。 ⒊转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化过程可以是自发的，和人工的，从肿瘤组织中。 三、常用生产用动物细胞的特性 W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。 核型为2n=46，成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME 。 MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。核型为2n=46，属成纤维细胞，培养基用加小牛血清。 CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型2n=20～22，DEME培养基 BHK-21:从5只生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的。成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM，加7%胎牛血清。 Vero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞，核型2n=60；培养基为199培养基 Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～14条标记染 色体。单条X，无Y。培养基为RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于生产α干扰素。 SP2/0-Ag14：通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，通常用培养基为DMEM Sf-9 1983年从亲代IPLB—SF21AE中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，用于高效表达外来蛋白制品。 四、基因工程细胞构建和筛选 被用构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。 ⒈真核细胞基因表达载体的构建 ⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 ⒈真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒 质粒载体 1、病毒载体 牛痘病毒：用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。 杆状病毒：用于外源基因表达。其优点有：①双链DNA，易重组；②插入7～8kb DNA不影响正 常病毒粒子的形成； ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子。 杆状病毒的优点 ④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全 部蛋白质20%～30%； ⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。 ⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因。 2、质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质 粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 ③能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。 ⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选 磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞