第三章基因工程的载体精要.ppt

3.质粒的转移???????????? ???????????????????????? （二）质粒DNA的制备 （三）质粒载体的构建 ⑴去掉不必要的DNA区段。 ⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。 ⑶加入易于捡出的选择性标记基因。 ⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。 ⑸改造或增加基因表达的调控序列。 pBR322质粒的优点： （1）具有较小的分子量。 4363bp，2.6×106Da， （2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。 （4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。 外源DNA （2）、pUC质粒载体 1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的 结构： （1）来自于pBR322的Ori （2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化 （3） LacZ′基因 编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。 （4）MCS区段 与pBR322相比， pUC质粒载体优点： （1）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝 （2）适用于组织化学法检测重组体 通过?-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。 （3）具有多克隆位点区段（MCS） 可以定向克隆防止载体自我连接。 ⑵温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 ⑶复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制 溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制 ⑷基因组成 ?DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。 粘粒载体功能与λ噬菌体类似，但由于λ噬菌体具有较大的多功能性和较高的克隆效率，仍然是目前构建基因文库时首选的克隆载体，粘粒载体只有在以下两种特定的情况下使用： ①在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因； ②克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段，即当载体克隆容量大具有明显优势时使用粘粒载体。 表3-1 部分柯斯质粒载体的基本特征 - - - + 外源基因在大肠杆菌中的表达 + - - +** 单链探针 + - - + 序列分析 - - - + 构建新型的DNA结构 - - - + 常规的亚克隆化 - - - + 构建DNA文库 - + + - 构建基因组文库 - + + ±* 克隆DNA大片段 单链噬菌体 柯斯质粒 λ噬菌体 质粒 四种常用载体的比较 * 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低 　　** 已有个别材料可用于此目的　　　　　　　　　　 第五节 其他载体 （一）人工染色体　 酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome,YAC） 细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome,BAC） P1派生人工染色体 （P1 phage artificial chromosome, PAC） 哺乳动物人工染色体 （Mammals artificial chromosome, MAC） 质粒载体（plasmid）可克隆20kb λ-噬菌体（λ-phage Vector）可克隆20kb 柯斯质粒（Cosmid）可克隆40kb大小片段 人类基因组十分庞大，约含3×109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC） 载体应运而生。 YAC载体可容纳100kb-2000kb以上DNA片段，是目前能克隆最大DNA片段的载体，对完成人类基因组计划及其它基因组计划具有重要意义。 1. YAC载体 随着分子生物学研究进展，人们对染色体DNA的结构与功能了解的比较清楚。人们发现下述部分对染色体的复制是非常重要的。 一是着丝粒（Centromere，CEN）：主管染色体在细胞分裂过程中正确分配到各子细胞中。 二是端粒（Telomere，TEL）：位于染色体末端，对染色体末端的复制及防止染色体DNA被外切酶切断有重要意义。 三是自主复制序列（autonomously replicating Sequence，ARS）即在真核生物DNA