第三章基因载体的选择与构建精要.ppt

* 其特点是插入的外源DNA没有明显的嵌合和缺失现象， PAC载体可以插入约300kb的外源片段，可以稳定遗传及高效扩增。 PAC除具有许多BAC载体的特征外，它的多克隆位点位于蔗糖诱导型致死基因sacB上，通过加入蔗糖和抗生素的培养基筛选出来的克隆都是含有插入片段的重组子。 * PAC 载体自身片段较大(约16kb) ，构建文库没有BAC 载体(约7～8kb) 效率高。PAC 载体在基因分离和序列分析当中，可作为YAC 连续克隆群的重要补充，日本水稻基因组计划(RGP) 已把水稻的PAC 文库用于物理图谱的构建。 * 但是YAC、BAC 载体不能直接进行植物转化，在候选克隆的转化互补实验中需要将外源片段进行亚克隆，因而工作量大，同时也有漏失目的DNA片段的可能。因此，可直接用于植物转化的大片段双元载体便应运而生，具有代表性的载体系统有BIBAC 和TAC。 * 六、其它大容量载体 双元细菌人工染色体(binary BAC, BIBAC) 可转化人工染色体( transformation-competent artificial Chromosome, TAC) 这些载体不仅具有较大的克隆容量，而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。 * 1.双元细菌人工染色体(binary BAC, BIBAC) 1996年，Hamilton等结合BAC载体和Ti质粒的特点，构建了双元BAC载体BIBAC2，该载体在结构上具有BAC的复制系统，又加入在农杆菌中起作用的Ri复制子和抗卡那霉素筛选标记及T-DNA的左右边界，因此BIBAC能在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭复制。 * * Bancroft等构建了pCLD04541双元载体，在T-DNA左右边界之间有一个dBS多位点接头，使重组子克隆产生更深的蓝色，这在低拷贝的双元载体中具有一定的优势。 * 2.可转化人工染色体( transformation-competent artificial Chromosome, TAC) Liu等结合PAC和双元载体的特点，构建了TAC载体pYLTAC7。 TAC载体具有P1复制子和Ri质粒pRiA4复制子，能在大肠杆菌和农杆菌中穿梭复制。 * pYLTAC7在其T2DNA右边界处插入了植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和Pnos启动子。在TAC载体中重组筛选标记是卡那霉素抗性基因和sacB基因。 * * TAC载体与BIBAC载体相比，首先大肠杆菌中的复制起点不同，TAC源于P1噬菌体；而BIBAC源于F因子。其次，TAC载体中具有P1裂解子(lytic replicon)，可以在IPTG的诱导下产生5～20个拷贝，提高了质粒产量。 目前已经构建了水稻、小麦、拟南芥、大豆、金鱼草等植物的TAC 基因组文库 * TAC载体与BIBAC载体一样具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌直接转化植物的功能。 TAC和BIBAC载体除具有BAC载体的优点外还具有以下优越性： 1) 具有大肠杆菌和农杆菌的复制子，是一个穿梭质粒，在大肠杆菌和农杆菌中均保持稳定。 2) 可通过农杆菌介导直接进行基因功能互补实验。 * Summary * 质粒：15~20kb左右 ?载体：20kb 凯伦(Charon) 载体：8.2～22.2kb 粘粒(cosmid) ：31～45kb BAC：100~300kb YAC：100～1000kb PAC：100～300kb BIBAC：100～300kb TAC：100kb * Some possible vectors for plant and animal cells Cell type Vector type Genome Examples Plant cells Plasmid Viral DNA DNA RNA Ti plasmid（A. tumefaciens） CaMV Geminiviruses TMV 烟草花叶病毒 Animals Plasmid Viral Transposon DNA DNA RNA DNA Various types, many contain SV40 genome Baculoviruses（杆状病毒） SV40, et al Retroviruses P elements in Drosophila 双生病毒 甘蓝花叶病毒 * 七 植物载体 质粒载体 病毒载体 * 质粒载体 根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。 它们能够诱发植物产生肿瘤 根瘤土壤杆菌中的质粒叫做Ti质粒，即诱发寄主植物产生肿瘤的质粒(tumor-inducing pla