第三章沉淀法精要.ppt

第二编? 纯化方法 沉淀法 离心法 电泳法 层析法 第二章 沉淀法（溶解度法） 是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法；优点：操作简单，成本低廉； 分类： 盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择沉淀 第一节 盐析法 原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶)．但当盐浓度增高到一定数值时、其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。 原因：在一定浓度的中性盐作用下，蛋白质颗粒失去电荷和水膜，则沉淀析出。这时所获得的蛋白质沉淀，能保留蛋白质原来的性质。 1．蛋白质的分级沉淀 常用中性盐：主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最广的是硫酸铵； 其优点： 温度系数小而溶解度大(25℃时饱和溶解度为4.1mol/L,即767g/L;0℃为3.9mol/L，即676g/L)，适合许多蛋白质和酶的盐析； 分级沉淀效果比其他盐好。比如：有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一步分组沉淀,就可除去杂蛋白75%以上； 不容易引起蛋白质变性，有稳定蛋白质结构的作用。比如将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年其性质没有变化； 硫酸铵价廉易得，废液可肥田。 (2)硫酸铵盐析的操作 在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。 注意： 控制加硫酸铵的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。 例如： 在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35%，尿素酶基本上仍留在溶液中。而饱和度达55％时．尿素酶几乎全都沉淀出来(见表2-1)。欲将蛋白质溶液变成一定的硫酸铵盐饱和溶液时，要加入的硫酸铵数量可从硫酸铵饱和溶液计算表查得。 ②饱和溶液加入法： 在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用下列公式计算： 优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和； 缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达到50％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。 ③透析盐析法 将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。 特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。 2．盐析曲线的制作 用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。具体步骤： 取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节pH至稳定范围，分6-10次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中．则得到第二个分级沉淀部分。 如此连续进行．便可得到6-10个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线，在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。 3.盐析的影响因子 每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在下列关系，即溶解度(S，以mg／ml表示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系，可用下面的公式表示: lgS＝β- Ka· M式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克分子浓度；Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分之溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。 Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。因此，对一种有效成分而言，Ka值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。 某一蛋白质的Ka值不仅与蛋白质本身的性质有关，而且与溶液的pH、温度和盐的种类等因子也有关。 (2)盐的分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的Ks值都很大，而且盐析范围(盐离子强度)差异明显，则分离效果好；若Ks值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果不好。 (3)pH和盐浓度 溶解度与pH和盐浓度有密切关系。当这两种因子变动时，溶解度将发生明显的变化。例如，兔肌甘油醛磷酸脱氢酶(等电点8.5左右)在PH＝6.0时，能溶于3.2mol/L(NH4)2SO4溶液，但当PH调至7时，立即产生沉淀，甚至有结晶析出。 选择适当pH的盐溶液，可提高对有效成分的盐析效果；另外硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些蛋白质的破坏，应及时用氨水调pH至中性或视有效成分的pH而定。 (4)蛋白质的纯度和浓度 蛋白质存在的形式(均一的，还是混合的)和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差。因此．一般控制样品液蛋白浓度在0.2％一2％为宜。 (5)其他