第三章生物催化剂的修饰与改造精要.ppt

2）增强酶的稳定性（热稳定性）。 α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的-NHCH2COOH后，该酶抗不可逆热失活的稳定性在60°可提高1000倍。这种稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。 木瓜蛋白酶用黄素共价结合修饰后，蛋白酶变成氧化还原酶。 1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 可作用基团： 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。 烷基化反应 2) 酰基化反应 试剂特点： 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr） 酰基化反应 3) 氧化和还原反应 试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 可被还原的侧链基团：二硫键。 蛋白质化学修饰的局限性 化学修饰的专一性是相对的； 酶的构象有些改变； 化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行 。 氨基酸酰化酶活性部位中的锌被钴取代时，酶的底物专一性和最适pH值都发生改变：锌酶对N-氯-乙酰丙氨酸的最适pH为8.5，而钴酶的最适pH是7.0；钴酶对N-氯-乙酰丙氨酸水解活力增强，而对N-氯-乙酰蛋氨酸的活力降低。 天然含铁超氧化物歧化酶的铁被锰取代，酶的稳定性和抑制作用发生显著变化，含锰酶对过氧化氢的稳定性增强，对NaN3抑制作用敏感性降低。 三、修饰酶的性质及特点 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高 抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。 半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定期，从而延长了在体内的半衰期。 最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。 Km的变化：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些没经修饰后，Km值变大。 4)巯基的化学修饰 来源：Cys 修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X － E-SR +HX N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基试剂） E－SH ＋ ? 5) 二硫键的化学修饰 还原：巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT） 氧化：过甲酸: Performic acid 6)咪唑基的化学修饰 来源：His 修饰反应:酰基化与烷基化 酰基化修饰剂: 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate） + ? + C2H5OH +CO2? 烷基化修饰剂：碘乙酸 + ICH2COOH ? + HI 7）酚羟基的化学修饰 来源：Tyr 修饰反应：芳香环取代反应 修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷） 8）吲哚基的化学修饰 来源：Trp 修饰反应：氧化反应 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺 2-羟基-5硝基苄溴 N-溴代琥珀酰亚胺 吲哚基 Trp 碘、四硝基甲烷 酚羟基 Tyr 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 咪唑基 His 三硝基苯磺酸、丹磺酰氯；2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸 氨基 Lys 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基 Cys 巯基乙醇、DTT 二硫键 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮 胍基 Arg 水溶性碳化二亚胺 羧基 Asp、Glu 修饰剂 侧链基团 氨基酸 各种氨基酸侧链的修饰剂 但解释修饰效果须十分小心，因为： ①任何一种修饰剂不是绝对专一的。 ②有些修饰剂引起蛋白质构象变化——失活， 不一定是活性中心基团被共价修饰。 ③不同部分的相同基团，修饰效果不同，分子内部的必需基团，不易被修饰。 （三）交联修饰