第三章第二节基因工程载体精要.ppt

第二节 基因工程的载体 种类: 质粒 噬菌体 腺病毒载体 逆转录病毒载体等 一、质粒的一般生物学特性 （一）、质粒DNA 1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。 2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。 （二）、质粒的拷贝数与不亲和性 1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。 根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。 二 质粒DNA的分离与纯化 常规的方法: 煮沸裂解法 SDS裂解法 碱裂解法 三、质粒载体的构建及类型 （一）质粒载体的发展概况； （二）质粒载体的特点（基本条件）； （三）遗传标记基因 （四）质粒载体的类型 （一）发展概况 1.??第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.??第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 （二）载体特点 1、 至少有一个复制起点 2、?至少应有一个克隆位点。 3、?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 ?注：前三个特点必不可少。 （三）遗传标记基因 1、 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS， lacZα），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。 2、?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类