第三章细胞培养及其在中医药中的应用精要.ppt

2 胰酶消化法 ⑴ 取材：将小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。 ⑵ 用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 ⑶ 用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。 ⑷ 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20～40分钟，每隔5分钟振荡一次. ⑸ 加入2ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。 ⑹ 静置，使未分散的组织块下沉。 ⑺ 吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，37℃下培养。 (一）培养细胞生命期 在培养中持续增殖和生长的时间。 1 原代培养期： 从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养） 特点：1～4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似、多呈二倍体核型 细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。 2 传代期： 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 3 衰退期： 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。 在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。 转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。 细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖 能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连 续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二 期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核 型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法 诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细 胞永生性和恶性性非同一性状。 （二）组织培养细胞一代生存期 　　所谓细胞“一代”一词，系指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 潜伏期 指数生长期 停滞期 1 潜伏期： 影响潜伏期的长短的因素： 细胞种类：传代比原代短，肿瘤与永生细胞比有限正常细胞短，胚胎细胞比成体细胞短 接种的细胞密度：密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。 培养条件：培养液、pH、 底物、污染与有毒 过程: 游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附:贴附底物,一般几小时内贴壁 潜伏期:可有运动与活动,基本无增殖, 少 见分裂相 2 指数增生期： 这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。 特点：　 　是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段 　培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一， 　是理想的实验用细胞 接触抑制 密度抑制 3 停滞期： 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。 特点 (1)细胞数量： 细胞达饱和密度，出现密度抑制。 (2)细胞活动小 (3)生长组分下降 (4)及时传代：细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况 潜伏期 指数生长期 停滞期 第四节 细胞计数及活力测定 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数，结果以每毫升细胞数表示。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 一 细胞计数原理 二 细胞计数操作步骤 1、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细