第三章酶的生产精要.ppt

Enzyme Engineering酶工程 第三章 酶的生产制备 酶的生产方式 生物合成法： 利用植物、动物、微生物细胞合成。 上个世纪50年代起利用微生物生产酶。 1949年细菌发酵生产淀粉酶 上个世纪70年代以来利用植物细胞和动物细胞培养技术生产酶。 木瓜细胞培养生产木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶 人黑色素瘤细胞培养生产血纤维蛋白溶酶原激活剂 动植物细胞培养的特殊性： 1、细胞比微生物细胞大得多，体积大几千倍， 2、对剪切力敏感，动物细胞没有细胞壁更甚 3、生长速率比微生物低，生长倍增时间和发酵周期均更长， 4、对营养的要求较微生物复杂，动物细胞往往需要添加血清和其他营养成分 3、酶的发酵生产 第一节 酶的生产菌种 一、生产菌种 1.细菌 芽孢杆菌（蜡状、枯草、地衣）、大肠杆菌 2.霉菌 黑曲霉、米曲霉、木酶 3.酵母菌 啤酒酵母、假丝酵母 4.放线菌 链霉菌 二、产酶菌种的要求 （1）不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活生物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。 （2）能在便宜的底物上生长良好，繁殖快，产酶量高，有利于缩短生周期 （3）产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。 （4）目标酶的产量要高，性能符合应用需要，产生的酶容易分离纯化，最好为胞外酶。 （5）除蛋白酶生产菌种外，其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低，防止目标酶的水解。 第二节 酶的发酵技术 一、培养基 C/N: 产酶促进剂: 诱导物 表面活性剂 二、发酵条件对产酶的影响 温度、pH值、通风量 三、发酵方法 第三节 提高酶产量的方法 一、酶合成的调节机制 1.操纵子 调节基因： 阻遏蛋白 辅阻遏物 2、诱导和阻遏 诱导： 诱导物的加入后，酶才大量合成， 参与分解代谢的酶：淀粉酶、纤维素酶 阻遏： 末端代谢物阻遏： 反馈阻遏，合成代谢中的关键酶 分解代谢物阻遏： 2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。 色氨酸操纵子——酶的阻遏 酶的诱导和阻遏操纵子模型 3.分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。 分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。 分解代谢物阻遏 （二）.通过条件控制提高酶产量 （1）添加诱导物 选择适宜的诱导物及浓度: 诱导物： 酶的作用底物 酶作用底物的前体 酶的反应产物 酶的底物类似物或底物修饰物等 IPTG/乳糖 纤维素/纤维二糖诱导纤维素酶 （2）降低阻遏物浓度 避免使用过于丰富的培养基和易被利用的碳源，并设法阻止效应物的形成和浓度的增加。 流加和连续培养 mRNA的稳定性，培养基中诱导物，反馈阻遏物，分解代谢物的存在是影响酶生物合成模型的主要因素。 mRNA稳定性 代谢调节 产物生成模型 同步合成型 (-) 诱导 dP/dt=α·dX/dt 延续合成型 (+) 诱导 dP/dt=α·dX/dt＋β·X 中期合成型 (-) 反馈阻遏 dP/dt=α·dX/dt （解除阻遏后） 滞后合成型 (+) 分解代谢物阻遏 dP/dt=β·X 目的：提高产酶率和缩短发酵周期 最理想的