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第二章 工具酶 Ⅰ 工具酶的功能分类： Ⅱ 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease，RE） I 型限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶 III 型限制性核酸内切酶 复合功能酶，具有多种功能 在DNA链上的识别和切割位点不一致 没有固定的切割位点，在距识别位点1至几个kb处随机切割 不产特异末端 属于复合功能酶 特点：在距识别位点约25bp处切割DNA，切割位点难以预测。 II 型限制性酶 1、特点 功能特点 识别和切割双链DNA的特定序列，产生特定的DNA末端。 EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT 识别序列特点 识别序列一般在4～6个碱基对，通常为反转互补序列，即具180°旋转对称性（又称回文结构） 2、酶切末端类型 平齐末端（blunt end）: 在识别序列的对称轴上对双链DNA进行切割，末端平齐。 粘末端（cohesive end or sticky end ) 在识别序列对称轴的相应位点切割，产生一个单链延伸的粘性末端。 3、几类特殊的II型限制性酶 异源同工酶 同尾酶 识别与切割顺序相互有关的酶。来源各异，识别序列也各不相同，但作用后产生相同的粘性末端。 远距离裂解酶 这类酶的识别与切割位点不一致，但其切割位点和识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。 MboII GAAGANNNNNNNN 可变酶 II类酶中一个特例，他的识别序列中有一个或几个核苷酸是可变的，且识别序列一般大于6个碱基对。 BstpI GGTNACC Bgl I GCC（N）4GGC 4、影响II 型限制性酶作用的因素 离子强度、pH的影响 如 MgCl2由5mM 2mM (pH8.5)酶对底物识别专一性降低 EcoRI EcoRI* GAATTC NAATTN 某些试剂可改变酶的专一性 如疏水试剂甘油，二甲基亚砜存在时，会使BamH I的识别和切割特异性发生改变。 酶量的影响 过量会影响酶的识别顺序 酶解温度和时间 Ⅲ 其他重要的工具酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 S1核酸酶-单链核酸内切酶 末端脱氧核糖核苷酸转移酶 特点：能够把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。 常用DNA聚合酶 大肠杆菌大聚合酶I及其Klenow片段 TaqDNA聚合酶 逆转录酶 大肠杆菌聚合酶I及其Klenow片段 Klenow片段 从大肠杆菌DNA聚合酶I全酶中除去 3′ 5′外切酶活性片段 Taq DNA聚合酶 是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，最佳作用温度位70～80℃，也具有5′3′外切酶活性 可用于 聚合酶链式反应（PCR）； DNA测序 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP） 多功能： 以RNA为模板5′3′方向DNA聚合酶活性；以mRNA为模板催化合成互补的DNA，称为cDNA 应用 构建cDNA文库；反转录PCR（RT-PCR) 2、DNA连接酶 3、碱性磷酸酶 4、末端脱氧核糖核苷酸转移酶 （Terminal deoxynuclotidyl transferase) 思考题 P P S P S P S S S P P P P S OH S P S P S S P P S P S HO S S S P P P P S P S P S P S S T A G C T A T A T A A T T A A T T A C G 5’ 3’ 5’ 3’ 去除DNA末端5’ 磷酸基团 A A T T C P S S S S P P S OH S P P P P S G T A A T P P S P S S HO P S P P S P S S A T A S S S P P P S S P P T A G C T A P P S T OH Recessed 3’ hydroxyl group Overhanging 5’ phosphate group extension 去除DNA片段 5’ 末端磷酸 以防自身连接 催化dNTP加到DNA分子的3’-OH末端，带3’突出的DNA为最佳受体。 应用 重组人工粘性末端； 用于DNA3’端标记——TUNEL凋亡检测 重组人工粘性末端 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases） 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DN