胶原蛋白降解物高效液相色谱／质谱联用分析.pdf

维普资讯 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology，2005，25(2)：66～72 胶原蛋白降解物高效液相色谱 ／质谱联用分析* 孙爱梅 张贵锋 倪 文 苏志国 (1北京科技大学土木与环境工程学院 北京 100083 2中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室 北京 100080) 摘要 利用高效液相色谱 ／质谱联用技术分析 了胶原蛋 白II和 I经变性和酶解处理得到的多肽 混合物 ，比较研究了两种类型胶原蛋 白降解物之间的区别，利用液相色谱质谱连用技术识别 出了 不同类型胶原蛋 白中的特征肽段。胶原蛋 白在50℃处理 3h可溶解于盐溶液，凝胶过滤分析结果 表明，热变性的胶原蛋 白分子量在 10万以上，因此在热变性过程 中胶原蛋 白的三螺旋结构被破 坏但没有明显的随机降解。利用胰蛋 白酶对胶原蛋 白进行 了酶切处理，在酶用量为2％，pH8．1 ～ 8．2，温度 37℃条件下，处理 20h后胶原蛋 白降解较完全 ，多肽混合物 的平均分子量在 1万以 下。利用液质联用技术研究 II型和 I型胶原蛋 白降解物 中的多肽 ，通过 多级质谱分析 了胶原蛋 白降解物多肽的序列。结果表明，不同类型的胶原蛋 白酶解后的多肽混合物中存在特定序列的 特征肽段 ，利用特征肽段进行胶原蛋 白类型识别是可行的。 关键词 胶原蛋 白 酶解 高效液相 色谱 质谱 胶原蛋 白是一种 由动物细胞合成的生物高分 布、分子组成各异的胶原蛋 白 。许多胶原蛋 白在 子，作为细胞外基质中重要的成份几乎存在于所有 常温下难溶于水，因此直接分析存在一定困难 。文 组织内，约 占哺乳动物总蛋白的 1／3。近年来 ，研究 献中通常使用特异性的酶或溴化氰部分降解胶原 发现许多疾病与胶原蛋 白密切相关，如胶原蛋 白的 蛋 白使其溶解于水溶液 。对于胶原蛋 白降解产 含量、分布、代谢及其动态变化异常会引起骨质疏 物的分析，1999年Mikgfk等 利用凝胶过滤色谱在 松、动脉瘤和椎间盘突出等疾病 。因此，建立快 SepdexG一15柱上实现 了I型胶原 a1链 、 链 、V型 速的胶原蛋 白分析方法不仅有利于疾病的早期诊 胶原和 I型胶原 CNBr肽的分离。凝胶过滤色谱是 断，也有助于认识致病机理等。另外，胶原蛋 白由 级分蛋白质和测定蛋 白质分子量分布的良好方法， 于 良好的生物学特性和弱抗原性在化工、保健品、 其缺点是色谱柱峰容量有限，分离度较低，不宜用 医学及材料等领域得到广泛应用，不同类型的胶原 于分子大小及组成相似或相差很小组分的分离。 蛋 白应用领域各异 ，建立快速的胶原蛋 白分析方 其他分析方法包括离子交换色谱 、反相色谱 、 法还有利于胶原类产品的质量控制 。 亲和色谱 、电泳或毛细管电泳 等。由于不同类 胶原蛋 白分子长约 300nm、直径约 1．5nm，由3 型胶原蛋 白降解物性质相似、分子量差别不大，因 条肽链 以平行 、右旋的形式缠绕而成，组成胶原蛋 此这些方法存在分辨能力较低、准确性差和重现性 白的a肽链 自身为左手螺旋结构。每条肽链的序 不理想等问题，不能对混合物中的不同胶原蛋 白同 列特征表现，为每隔两个其它氨基酸残基即有一个 时进行检测 。 甘氨酸，其序列可用 Gly—X—Y表示(X常为脯氨酸， 针对 目前胶原蛋 白分析方法中存在的不足，本 Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸)I3]。根据构成其肽链 研究旨在探索利用质谱检测特征肽段进行胶原蛋 的差异，胶原蛋 白可分为多种类型，目前人们在脊 白类型识别的可行性 。实验通过热变性的方法将 椎动物中已鉴别出至少 27种大小、序列、组织分 胶原蛋白进行溶解，利用胰蛋 白酶对热变性的胶原 蛋 白进行了酶切处理。利用液相色谱／质谱联用技 收稿13