差速离心分离植物（动物）细胞核.pdf

中国试剂网 2.4.11 差速离心分离植物（动物）细胞核 线粒体和细胞核的制备与观察 利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方 法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。（差速离心技术） 线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。将动植物组织制成匀浆， 在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用 离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的 黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内 含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间， 就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞 器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。 悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能 保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团， 有利于分离。整个操作过程样品要保持在 0℃~4 ℃，避免酶失活。 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内 膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿 B 染料保持在氧化状态呈现蓝绿 色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 詹纳斯绿 B 是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒 害的染色。由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面 带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸 引作用，染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的 真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细胞的死亡。 Gimesa 是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水溶液中电离 中国试剂网 2.4.11 为带正电和负电的染料离子。 ***材料： 鼠肝脏， 猪肝脏 ***试剂： （1）0.25mol/L 蔗糖-0.01mol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris ）-盐酸缓冲液（pH7.4 ） 0.1mol/L 三羟甲基氨基甲烷溶液 10ml 0.1mol/L 盐酸 8.4ml 加双蒸水到 100ml，再加蔗糖使浓度为 0.2mol/L （2 ） 0.34mol/L 蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4 ），配法同上。 （3 ） 1%詹纳斯绿 B （Janus green 染液，称取 50mg （pH7.4 ），詹纳斯绿 B 溶 于 5ml 生理盐水中，稍微加热使之溶解后，过滤，即为 1%原液。 （4 ） 姬姆萨染液（Giemsa ）：称取姬姆萨粉0.5g，甘油 33 ml 、纯甲醇 33ml 。 先在姬姆萨粉中添加少量甘油，然后在研钵内研磨至无颗粒状，再将剩余甘油倒 入混匀，56℃左右保温 2h 使其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液， 保存于棕色瓶。使用时吸出少量，用 1/5mol/L 磷酸缓冲液作 10~20 倍稀释。 （5 ） 1/15 mol/L 磷酸缓冲液? （pH6.8 ） 1/15 mol/ L 磷酸二氢钾 （KH2PO4 ）50 ml 1/15 mol/ L 磷酸氢二钠（Na2HPO4 ） 50 ml 卡诺（Cornay ）固定液：无水乙醇 6 ml 冰醋酸 1 ml 氯仿 3 ml （7 ）生理盐水 ***仪器（请参看仪器图库）：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻 中国试剂网 2.4.11 度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。 1、制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹 12 小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生 理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织 1 g，剪碎；用预冷的 0.25mol/L 蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加 9 m