大孔吸的附树脂lx-20从发酵液中分离纯化维生素b12.pdf

离子交换与吸附，2011，27(4)：368—374 IONEXCHANGEANDADS0RPTION 文章编号：1001．5493(2011)04．0368．07 大子L吸附树脂LX20从发酵液中分离纯化维生素B12 张智聪 郑 珩料 顾觉奋料 中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009 摘要：对从脱氮假单胞茵发酵液中分离纯化维生素B】2的方法进行了研究。通过对 11种弱极 性大孔树脂进行筛选，确定LX．20为最适合树脂；对饱和树脂进行静态洗脱和动态洗脱，确定 75％甲醇水溶液为洗脱剂，加入醋酸有利洗脱。利用薄层法对粗品进行精制。最终建立工艺路 线为发酵液预处理后，LX一20吸附饱和，合醋酸的75％甲醇洗脱，经适当放大后结果仍好。此 法洗脱高峰集中，产品纯度达90％，回收率可达98％~X上，所得精品经HPLC检测纯度为97．8％。 关键词：大孔吸附树脂LX．20；维生素Bl2；发酵液；分离纯化 中图分类号：0647．3 文献标识码：A 1前 言 维生素B12(VitaminB12，VB12)又称钴胺素 (Cobalamin)，是一类含有咕啉环化合物的 总称。1926年Minot和 Murphy从肝脏抽提物中发现了VB12Ll】，1956年剑桥大学Hodgkin 确定了其晶体结构[2】，分别获得 1934年和 1964年的诺贝尔医学奖；1960～1972年，由美国 和瑞士完成了VB12的化学合成3【】。自然界中，腺苷钴胺素 (辅酶 B12)、甲基钴胺素和羟钴 胺素是微生物合成的最终产物。工业生产中加入氰化物使各种天然形式的钴胺素转化为稳 定的氰钴胺素4【】。VB】2是一种重要的水溶性维生素，以辅酶形式参与各种代谢，促进DNA 和蛋白质的合成；缺乏VB】2时会发生恶性贫血、神经系统的损害。临床上用于治疗恶性贫 血、肝脏疾病、神经炎、神经痛等l5J。在饲料工业上，可用于促进猪、鸡等牲畜的生长。 采用化学合成生产VB12的方法成本高，副产物多，难 以提纯。VB12的发酵生产方法o【 主要有：(1)抗生素废液中提取；(2)放线菌发酵；(3)丙酸菌发酵；(4)采用转基因的E．Coli 发酵生产。脱氮假单胞杆菌 (Pseudomonasdenitrificans)是近年兴起的新型VBl2好氧发酵 产生菌种[7】，具有生长快且产率高等优势，所产生的VB12以相对稳定羟钻胺素为主要形式， 避免了在转化过程中加入剧毒氰化物的危险。 维生素B12的分离纯化，常用乙醇、氯仿等有机溶剂[8】或苯酚和水的混合液[9-101萃取， 但萃取法已不能满足当今工业生产的需求。人们尝试用离子交换树脂提取维生素B12，取得 } 收稿日期：2010年9月3日 作者简介：张智聪(1987～)，男，在读博士研究生． 通讯作者 E—mail：zhengh18@hotmaf1．tom E一l／lai]-yqyan1@126．tom 第27卷第4期 离 子 交 换 与 吸 附 ·369 了较好的效果。大孔吸附树脂吸附剂具有选择性好、解吸容易、理化性质稳定、机械强度 高、可反复使用和流体吸力较小等优点1【¨。特别是可按照需要，选用合适的孔隙大小、骨 架结构和极性的树脂。实验证明1【】用大孔吸附树脂提取VBl2，饱和吸附量高，洗脱高峰集 中，洗脱剂用量少，优势明显。 由于国际市场对VB12的持续需求和国内市场的巨大潜力，我国发酵生产VBl2的规模 不断扩大 】【引。本文从应用角度出发，根据 VB12的结构特点和理化性质，有 目的地选择了 l1种弱极性大孔吸附树脂进行筛选，寻找饱和吸附量大、吸附速率快、解吸容易的树脂， 并研究了树脂的最佳洗脱剂。选择最适宜的条件进行了适当的放大试验，结果令人满意。 2材 料 2．1 发酵液 脱氮假单胞菌发酵液 (中国药科大学微生物制药教研室，自制)。 2．2 主要仪器与试剂 Agilent一1200高效液相色谱仪 (紫外检测器)，汉邦ODS色谱柱，离心机 (上海医用分 析仪器厂LXJ—IIB)，旋转蒸发仪 (上海 申胜生物技术有限公司R201)~醋酸，甲醇，乙醇， 丙酮等 (均为分析纯，南京化学试剂有限公司)：硅胶