蛋白质的的分离纯化.pdf

生物化学与分子生物学实验原理 （I ）-蛋白质的分离纯化 李 卫 芳 李 卫 芳 生物秀—专心做生物！ 生物秀 — 专心做生物！ 生物秀论坛-专注于生命科学！ 生物秀论坛 - 专注于生命科学！ /bbs/ /bbs / 高效液相­HPLC  （High­Performance Liquid  Chromatigraphy）  High Performance Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography  高压、高速、高分辨率、高灵敏度 •介质一般为在高压下稳定的衍生化硅胶，颗粒小 （1­10 μm），可提高理论塔板数到10万/m。  •要求有较 自动的进样装置，高压泵，和预装住。  •有较自动的商品化的系统供应 ÄKTA FPLC The principle of chromatography  Question 1 : How chemically similar compounds can be  separated in a chromatographic column?  sample  mobile phase  A+B  B  A  B  A B  A  B  t 1  t 2  t 3  t 4  t 5  保留时间  • 从进样开始到达检 测器所需要的时间.  – 在峰尖的位置测量  • 影响 t  的因素有:  R  – 流动相的线形流速  – 色谱保留 色谱保留  • 被分析物 (样品成份) 在两相之间的平衡  A  A  mobile  stationary 用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：  ( ⅰ)  Standard deviation标准 偏差(s)：即0.607倍峰高处色 谱峰宽度的一半。  (ⅱ)  The half­band width半峰 宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的 宽度 Y1/2 =2.354 s  (ⅲ)  The base­line