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第5章的_现代色谱技术简介
第五章 现代色谱技术简介
第一节 高效毛细管电泳分析法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)
概述
发展
1937年,Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间,两端施以电压进行自由溶液电泳——第一次的自由溶液电泳。
1981年,Jorgenson和Luckas,用75m内径石英毛细管进行电泳分析,柱效高达40万/m,促进电泳技术发生了根本变革,迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳分析法。
特点
仪器简单、易自动化
分析速度快、分离效率高
操作方便、消耗少
应用范围极广
高效毛细管电泳理论基础
高效毛细管电泳(HPCE)基本原理
电泳:带电离子在电场中的定向移动,不同离子具有不同的迁移速度。
当带电离子以速度在电场中移动时,受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力:
阻力:
故:
-离子所带的有效电荷;-电场强度;-离子在电场中的迁移速度;-平动摩擦系数 ( 对于球形离子:,-离子的表观液态动力学半径;-介质的粘度)。所以,迁移速度:
淌度(mobility) :单位电场强度下的平均电泳速度。
淌度不同是电泳分离的基础。
电渗现象与电渗流
电渗流现象
当液体两端施加电压时,就会发生液体相对于固体表面的移动,这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流(electroosmotic flow ,简称EOF)。
HPCE中电渗流的大小与方向
电渗流的大小用电渗流速度V电渗流表示,取决于电渗淌度和电场强度。
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质:
内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极;
内表面带正负电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极;
石英毛细管;带负电荷,电渗流流向阴极;
HPCE中电渗流的流形
电荷均匀分布,整体移动,电渗流的流动为平流,塞式流动(谱带展宽很小);
液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁处流速为零,管中心处的速度为平均速度的2倍(引起谱带展宽较大)。
HPCE中电渗流的作用
可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离;
改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性;
电渗流的微小变化影响结果的重现性。
HPCE中影响电渗流的因素
电场强度的影响
电渗流速度和电场强度成正比,当毛细管长度一定时,电渗流速度正比于工作电压。
毛细管材料的影响
不同材料毛细管的表面电荷特性不同,产生的电渗流大小不同;
电解质溶液性质的影响
对于石英毛细管,溶液pH增高时,表面电离多,电荷密度增加,管壁zeta电势增大,电渗流增大,pH=7,达到最大;pH3,完全被氢离子中和,表面电中性,电渗流为零。分析时,采用缓冲溶液来保持pH稳定。缓冲溶液离子强度增加,电渗流下降。
温度的影响
毛细管内温度的升高,使溶液的黏度下降,电渗流增大。
添加剂的影响
加入浓度较大的中性盐(如K2SO4),溶液离子强度增大,使溶液的黏度增大,电渗流减小;
加入表面活性剂,可改变电渗流的大小和方向,如加入阴离子表面活性剂,如十二烷基硫酸钠(SDS),电渗流增大;
加入有机溶剂如甲醇、乙腈,使电渗流增大。
HPCE中的参数
迁移时间(保留时间)
分离效率(塔板数)
分离度
影响分离效率的因素——区带展宽
纵向扩散的影响
在HPCE中,纵向扩散引起的峰展宽。由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小,可获得更高的分离效率——大分子生物试样分离的依据。
进样的影响
当进样塞长度太大时,引起的峰展宽大于纵向扩散,分离效率明显下降。
焦耳热与温度梯度的影响
散热过程中,在毛细管内形成温度梯度(中心温度高),破坏了塞流,导致区带展宽。
改善方法:减小毛细管内径;控制散热。
溶质与管壁间的相互作用
存在吸附与疏水作用,造成谱带展宽。
细内径毛细管柱,一方面有利于散热,另一方面比表面积大,又增加了溶质吸附的机会。
改善方法:加入两性离子代替强电解质,两性离子一端带正电,另一端带负电,带正电一端与管壁负电中心作用,浓度约为溶质的100-1000倍时,抑制对蛋白质吸附,又不增加溶液电导,对电渗流影响不大。
其他影响因素
电分散作用及“层流”现象。
高效毛细管电泳的分离模式
毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis ,CZE)
正离子:两种效应的运动方向一致,在负极最先流出;
中性粒子:无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出;
阴离子:两种效应的运动方向相反;V电渗流 V电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。
胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic c
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