第十章的_高效液相色谱法.pdf

教学重点：高效液相色谱原理与种类 第十章 高效液相色谱法 第一节 高效液相色谱 （HPLC）法简介 高效液相色谱法是继气相色谱之后，70 年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新 色谱技术。 高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相 色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了 自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期 长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送 （最高输送压力可达 7 4.910 Pa ）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液 相色谱 （每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进 行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们 称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。 一、 液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相— 固定相和流动相组成。液相色谱的固定 相可以是吸附剂、化学键合固定相 （或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多 孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在 固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 色谱分离的实质是样品分子 （以下称溶质）与溶剂 （即流动相或洗脱液）以及固定相分子间 的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、 离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。（正相、反相和疏水作用色谱）。 二、 液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一 致。液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色 谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的性质不相同；此外，液相色 谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别， 主要有以下几方面： （1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物 质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定 程度的限制，据统计，只有大约 20% 的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱则不受样品 挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、 离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 ~ 80% 。 （2 ）液相色谱能完成难度较高的分离工作 原因： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用， 样品分子只与固定相相互作用。而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离 的选择性。 ②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和体积排阻色谱。 等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。 5 （3 ）由于液体的扩散性比气体的小 10 倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应 就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4 ）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制 备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色 谱技术是互相补充的。 综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、 应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、 生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 三、HPLC 的应用 由于HPLC 分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分 析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋 白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物 等分析，大多是通过HPLC 来完成的。 右图是各种HPLC 方法的应用