高效液的相色谱.doc

高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography（HPLC） 7.1 概述—高压液相色谱法 HPLC 高效液相仪: 流动相：液体 固定相：柱子采用十分细小的颗粒填充，高效分离柱，高压泵输送流动相，柱后连高灵敏度检测器，对流出物连续检测。 高交效液相色谱分析过程 高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 7.1.1 高效液相色谱发展历史 1903年 茨维特发明液相色谱 1931年 Kuhn, Lederer， 液固色谱分离结晶胡萝卜素为(和(异构体， 同年制得叶黄素结晶， 1938年 从维生素B中分离出B6。1938年获诺贝尔化学奖 1958年 Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，成为研究蛋白质和酶的重要工具。 1972年获得诺贝尔化学奖。 1968年 出现商品化的高效液相色谱仪 7.1.2 高效液相色谱的特点 高效液相色谱 色谱柱：柱长10~200cm，内径10~50mm 色谱柱：柱长10~25cm，内径2~10mm 常压或减压 高压，40~50MPa 填料颗粒大，75~600(m（200~30目） 填料颗粒小，2~50(m（2500~300目） 柱效低，20~50/m 柱效高，40000~60000块/m 分析速度慢，1~20h 分析速度快，0.05~1.0h 色谱柱只用一次 色谱柱可重复多次使用 不能在线检测 能在线检测 气相色谱法与高效液相色谱法比较 气相色谱 高效液相色谱 只能分析挥发性物质（约20%的物质） 几乎可以分析各种物质 不能用于热不稳定物质的分析 可以用于热不稳定物质的分析 用毛细管柱色谱可得到很高的柱效 色谱柱不能很长，柱效不会很高 有很灵敏的检测器（ECD）和较灵敏的通用检测器（FID,TCD) 有灵敏度较高的通用检测器（ELSD） 流动相为气体，无毒，易于处理 流动相有毒，费用较高 运行和操作容易 运行和操作比GC难一些 仪器制造难度较小 仪器制造难度较大 分析对象不同、改变选择性的主要途径不同、分离效率不同、平衡时间不同、操作温度不同、仪器设备不同 GC：载气与组分无亲合力，体系和类型少，高温，柱外效应可忽略 缺点，只分析可气化的试样 HPLC：流动相对组分有亲和力，体系多，类型多，低温，可回收样品，柱外效应较大，缺通用型检测器，成本高 2. 高效液相色谱的应用范围7.1.3 液相色谱的分类 7.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素涡流扩散项纵向扩散项传质阻力项液液色谱 传质阻力系数C=流动相传质阻力系数+固定相传质阻力系数流动相中的传质阻力项滞留的流动相中的传质阻力项固定相传质阻力项7.3 高效液相色谱仪 7.3.1 高压输液系统 : 1. 构成：储液罐/高压输液泵/过滤器/压力脉动阻力器 2. 储液罐：盛入溶剂，连过滤器，防止颗粒进泵 3. 高压输液泵: 密封性，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。 压力：150～350×105 Pa。 作用：将流动相在高压下，连续不断地送入色谱系统。 高压目的：输送流动相及组分。保持渗透性和快速分析。 装置：双活塞往复泵：稳定输出流量。 7.3.进样系统 1. 作用：将试样引入色谱柱 对分离产生影响：柱外展宽（柱前和柱后展宽） 原因：进样系统、连接管道及检测器中存在死体积 2. 进样装置：隔膜注射进样器高压进样阀：六通阀进样装置 7.3.3分离系统-色谱柱和流动相 1. 色谱柱 作用：分离 材料：内部抛光不锈钢管 外型：内径：4mm ～ 5mm 柱长：10cm ～ 50cm 高效：填料粒度小：5~10μm 塔板数：7 000 ～10 000 固定相 要求：耐高压 基体：实心玻璃珠 多孔活性材料：μm 的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，发展了反相液相色谱。 80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 ～ 10 μm 球形硅胶。 90年代早期，粒径为 5 μm 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。 90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 μm 或 3.5 μm 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。 21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 μm 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。 目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。 目前应