土壤微的生物的分离鉴定.doc

土壤微生物的分离鉴定 试验一 土壤的采集一、实验目的：学习土壤的采集、处理方法二、实验原理：土壤样品的采集方法对分桥结果和评价至关重要。因此，采集的样品必须具有代表性。三、实验器材?无菌牛皮纸袋，无菌铲，长线，标杆，标签四、试验方法：由于土壤自然条件、类型和污染状况不同，采样的方法也不同，按照“随机”、“等量”和“多点混合”的原则进行采样，常用的方法有：(1)对角线采样法。这种方法适宜于受到废水污染或污水灌溉的田块。由田块进水口向对角引一条斜线，将此线分成三等份或五等份，在每等份的中央点取样。(2)蛇形采样法。这种方法适宜于面积较大，地形不平坦，土壤不均匀的田块。采样品按蛇形多布置一些。(3)棋盘形采样法。对于面积适中、地势平坦，地形完整的田块，适合用这种采样法。如土壤不均匀，布置10个以上的采样点．土壤均匀，采样点可少些。(4)梅花形采样法。对于面积不大，地势平坦，土壤较均匀的田块，适合用这种方法。梅花形采样的布点以5—10个为宜。用上述采样法采样应注意采样深度、采样时间、采样量及样品的处理和保存。（5）一个混合土样以取土1公斤左右为宜，如果样品数量太多，可用四分法将多余的土壤弃去。方法是将采集的土壤样品放在洁净的塑料布上，弄碎、混匀，铺成四方形，划对角线将土样分成四份，把对角的两份分别合并成一份，保留一份，弃去一份。如果所的样品依然很多，可用四分法处理，直至所需数量为止。 ????(1)采样深度，对一般土地采样深度15—30cm即可。对根深的作物可取至50cm的深度。大田作物采样深度一般为0-20厘米，菜田0-25厘米，果园0-40厘米。采样时深度要垂直，上下取土量要一致???(2)每个采样点的取土深度及采样量应均匀一致，土壤上层与下层的比例要相同。取样器应垂直于地面入土，深度相同。用铁锨取样应先铲出一个耕层断面，再平行于断面下铲取土。(3)采样时间，粮食作物及蔬菜在收获后或播种前采集，随时采样分析(4)采样量，1—2kg土量。（5）预处理及保存．将采集的样品平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并拣除植物根、茎、叶及石块杂物，经20号筛筛分。（6）样品标记：采集的样品放入统一的灭过菌的牛皮纸袋样中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。注：耕种田、肥沃的土壤有机质充足，阳光水分充足，适合细菌和放线菌；要采集霉菌、放线菌要到森林、植被等湿润的地方。采集的菌种最好在春季和秋季，此时的微生物生长旺盛，如果是极端环境生长的菌种除外。实验二制备土壤稀释液一、实验目的：学习用浓度梯度法配置土壤稀释液二、实验仪器及试剂：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸头、试管、无菌水、土样三、实验步骤：称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，各种稀释度的土壤溶液。注：无菌操作：【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。实验三培养基的制备一,实验目的学习细菌,放线菌及真菌常规培养基的制备方法;二,实验内容牛肉膏蛋白胨培养基的制备;