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液相色谱实用技术（一） 流动相及样品的预处理 液相色谱对流动相的要求 除色谱柱对流动相的要求外，还有∶ 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长 流动相的脱气 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 流动相脱气的方法 加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 超声波 简单，但效果不理想。 通惰性气体（一般用氦气） 可保持连续脱气 在线脱气机 可保持连续脱气 样品的预处理 样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 样品预处理的重要性 占样品分析时间的比例（ 60%） 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤 样品预处理常用的方法 高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 萃取 索氏抽提 衍生反应 新技术--戴安公司的ASE快速溶剂萃取 液-固萃取 / 液-液萃取 固相萃取样品小柱 样品预处理的过程 去除微粒 过滤 过滤膜/过滤装置 有机(0.5m)/无机(0.45m) 膜片可更换 一次性使用的膜“Cartridge” 使用方便简单，交叉污染小 有更小内径，可用于微量样品的处理 高速离心 大于：10,000g 超 滤 机理 超滤是一种基于分子量分离的技术 目的 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 除去小分子样品中的大分子蛋白 脱盐 选择性沉淀 常用于生化样品中除蛋白 有机溶剂 乙腈，甲醇 强酸 三氯乙酸，过氯酸 盐 50% 硫酸铵 10% TCA 样品衍生 提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析 AccQ-Tag 衍生法 三种不同型号的ASE ASE在环境样品中分析二噁英和呋喃的应用（EPA3545A标准方法） 检测： PCDDs: 多氯二苯二噁英 PCDFs: 多氯二苯呋喃 OCPs: 有机氯农药 OPPS: 有机磷农药 环境样品基质 ：烟囱砖灰、城市尘埃、飞尘和沉积物 ASE萃取条件： 溶剂：二甲苯或二甲苯/乙酸（5%，V/V) 温度：175-200oC 静态时间:5-15分钟 冲洗体积：60-70% 静态循环次数：2-3次 ASE?的应用领域 浓缩样品 浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/固相萃取小柱 固相萃取（SPE）技术 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中60~80%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性 SPE小柱 固相萃取技术（SPE） SPE 小柱的应用领域 除去杂质及干扰组份 把样品分成不同极性的组分析 富集微量的组份 SPE 小柱的主要种类 反相 正相 离子交换 Sep-Pak的种类 根据Sep-Pak及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开 让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用 让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上 让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱 各种Sep-Pek小柱（一） 正相 包括∶Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina 可先用6到10倍柱体积的非极性（通常是样品溶液?）平衡 加入样品 用非极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更强的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 在不同条件下，有些填料可以用于反相或离子交换，如∶NH2 / CN 确认回收率 各种Sep-Pek小柱（二） 反相 包括∶C18 / C8 / Diol / NH2 / CN 可先用6到10倍柱体积的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍 柱体积的水或缓冲液平衡，不要让小柱干了 样品溶解在强一些极性的溶剂中 加入样品 用强极性溶剂洗脱不想要的组份 用极性弱些的溶剂洗脱第一组感兴趣的组份 用极性更弱的溶剂洗脱剩下的感兴趣的组份 确认回收率 各种S