3 初级分离.ppt

第三章 初级分离 3.1 沉淀分级 定义：沉淀（Precipitation）是物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。 沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产物。 目前广泛应用于蛋白质等生物产物的分离。 优点：设备简单，成本低，收率高, 浓缩倍数高，操作简单。 缺点：过滤困难，产品质量较低，针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强。 常用沉淀方法的分类 3.1.1 蛋白质的表面特性 蛋白质沉淀的两大屏障：1）蛋白质周围的水化层; 2）蛋白质分子间的静电排斥作用。 静电斥力 3.1.2 盐析沉淀 一、原理 盐析（Salting-out ）：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象。 吸引力 （与离子强度有关） 盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度下降 离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式 S—蛋白质溶解度，g/L; I—离子强度 β和Ks的物理意义 β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。 Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析的方法； Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。 β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。 二、影响盐析的因素 对特定的蛋白质 (一)无机盐种类 离子半径小﹑电荷较多的阴离子盐析效果较好 阴离子盐析效果： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 盐析用盐的选择： 1 溶解度大； 2 受温度影响较小； 3 盐溶液密度不高，利于沉淀的沉降或离心分离 4 盐析用盐必须是惰性的,不影响蛋白质的活性 5 来源丰富、经济 常用的盐析盐是(NH4)2SO4，此外还有Na2SO4和NaCl。 盐析用盐的用量选择 以硫酸铵为例： 250C时，硫酸铵的饱和溶解度是761g/L 定义为100%饱和度 如果沉淀某一种蛋白质需要60%饱和度的硫酸铵，那么需要硫酸铵固体的量是多少？ 三、盐析操作(以硫酸铵为例) 确定沉淀目标蛋白质所需硫酸铵饱和度的实验步骤（设操作温度为0℃）： 取部分料液，分成等体积的几份，冷却至0℃； 用下式计算饱和度达到20％-100％所需加入硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌1h以上，同时保持温度在0℃； 3000g下离心40min，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度； 分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒； 以上清液中总蛋白和目标蛋白浓度对饱和度作图，从而可根据所要求达到的目标蛋白纯化倍数和回收率确定硫酸铵的加入量。 四、应用 由于盐析沉淀后产物中盐含量较高，故一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。  3.1.3 等电点沉淀 定义：利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法（Isoelectric precipitation）。 操作条件： 低离子强度； pH?pI。 一般适用于疏水性较大的蛋白质（如酪蛋白），而对于亲水性很强的蛋白质（如明胶）则不太适用，故其不如盐析沉淀法应用广泛。 特点： 优点：很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内,而无机酸价格低廉，为食品允许，可直接进行其他纯化;无需后续的脱盐操作。 缺点： 1 容易引起目标蛋白质的失活； 2 不能获得高的回收率。 3.1.4 有机溶剂沉淀 定义：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表面水化程度降低，从而发生沉淀的方法。 操作条件： 低离子强度；0.01~0.05mol/L 等电点附近。 特点： 优点：分辨率高于盐析；有机溶剂易挥发，无残留，产品清洁；有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；不需后续脱盐处理。 缺点：易引起蛋白质变性，须在低温下进行；成本较高。 3.1.5 其他沉淀法 一、热沉淀（Thermal precipitation) 定义：利用在较高温度下，热稳定