7-3 液相色谱法.ppt

3、特点： 高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。 与气相色谱法相比，其最大的特点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 高效液相色谱法的分类 按色谱过程的分离机制： 吸附色谱法：固定相为吸附剂，依组分在吸附剂上吸附能力的差别而达到分离的目的。 分配色谱法;固定相为液态,利用样品组分在固定相与流动相中的分配系数的差别达到分离的目的. 空间排阻色谱法:采用凝胶作为固定相,依样品组分的分子尺寸与凝胶孔径间的关系,即渗透系数的差别而分离. 离子交换色谱法:离子交换树脂为固定相,依样品离子与固定相表面离子交换基团的交换能力的差别来分离. 亲和色谱法:将具有生物活性的配基(如酶,抗体等)键合到载体或基质表面上形成固定相,利用蛋白质或生物大分子与固定相表面上配基的专属亲和性进行分离. 化学键合相色谱法:将特定的官能团键合到基质表面,所形成的固定相为化学键合相.采用化学键合相的色谱方法称为化学键合相色谱法. 第二节 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。 分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 一、高压输液系统 高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表 等组成。 1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。 对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。 高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关; 恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。 3、脱气：（在线脱气装置，离线脱气）超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。 4. 梯度洗脱装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。 梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。 三、分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱是色谱仪的心脏. 1）对色谱柱的要求：柱效高、选择性好、分 析速度快；内壁光滑的优质不锈钢柱，柱 接头的死体积尽可能小。柱长多为10 ~ 30 cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大 于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。 四、检测系统 检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。 在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类