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亲和色谱 主要内容 生物亲和作用 亲和色谱及原理 亲和色谱介质 亲和色谱过程分析及应用 其他亲和分离技术 Affinity Chromatography 生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种特异性相互作用称为亲和作用。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术，其代表为亲和层析法Affinity chromatography。 亲和作用结构特点 立体结构中含有某些亲和结合的部位，这些呈陷或凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子的凹陷部位，就象钥匙和锁孔的关系一样。蛋白质分子表面的凹陷凸起部位与整个蛋白质分子相比要小得多，如，IgG直径一般为几纳米到十几纳米，而结合部位的直径一般为1~2nm。 亲和作用的作用力 具有“钥匙和锁孔”的关系是产生亲和结合作用的必要条件，但并不充分。除此之外，还需要分子或原子水平的各种相互作用. 亲和作用的影响因素 1)．离子强度 如Affinity主要源于静电引力或氢键，则提高 I 无疑会减弱或完全破坏Affinity。 疏水性作用随 I 提高而增大, 因此，当Affinity作用主要源于疏水性相互作用时，增大 I 则可提高Affinity。 许多亲和吸附的目标蛋白质可用高浓度盐溶液洗脱，说明静电引力在Affinity中占有重要地位。 2)．pH 在亲和分离操作中, 溶液pH值的选择是非常重要的. 3).抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成. 因此,如果Affinity中存在氢键,则加入脲或盐酸胍可减弱Affinity。但他们为强烈变性剂。 4)．温度T T ?使分子和原子的热运动?，结合中心的静电作用、氢键及金属配位键?，但可使疏水性作用?。 5)．离子 SCN-，I-和ClO4-等半径较大的阴离子能降低疏水相互作用。则这些离子会降低Affinity。 6). 表面活性剂/乙二醇 7)．鳌合剂 如果Affinity源于亲和分子对与金属离子形成的配位键，则加入乙二胺四乙酸EDTA等鳌合剂除去金属离子，可使Affinity消失。 3rd pH Value 4th 杂蛋白 亲和色谱洗脱 可控制的条件 1st 离子强度 2nd pH 3rd 抑制氢键形成的物质 按洗脱方式分类 1st 线性洗脱 2nd stepwise洗脱(最常用） 亲和集成技术 1 亲和膜过滤 2 亲和错流过滤 3 亲和双水相分配 4 亲和反胶团萃取 5 亲和沉淀 1 亲和膜过滤 传统亲和技术存在的问题: 1st 固定床型亲和层析利用多糖凝胶为固定相，床层压降随流速线性增大；由于软凝胶的机械强度较低，容易发生压密现象(受压变形)，在较高压力下，流速随压力提高而下降。因此，利用软产胶为固定相的层析操作速度有限. 2nd 用刚性粒子(如硅胶)为固定相虽然可通过增大压力提高流速，但高压操作势必增大设备投资。 1 亲和膜过滤 设计比较: 柱高/直径 = 250/4.6 = 54.3 1 亲和膜过滤 . 1 亲和膜过滤 亲和膜色谱 原理 优点 传质阻力小, 达到吸附平衡的时间短; 压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。 膜介质种类多。 缺点 分离效率 膜污染 2 亲和错流过滤 超滤膜/微滤膜存在问题: 孔径有很宽的分布范围，因此，单纯的超滤/微滤分离蛋白质等生物大分子的选择性很低，一般只有当两种组分的分子量相差10倍以上时才有可能得到完全分离。 办法: 亲和错流过滤(affinity cross-flow filtration) 亲和过滤(affinity filtration) 亲和超滤(affinity ultrafiltration) 是亲和技术与膜分离相结合的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形. 优点(兼备亲和吸附与膜分离): 1st 亲和作用高选择性 + 不溶性微粒固定相的亲和配基，从而增大目标分子与杂分子的尺寸差别，大大提高膜分离的选择性。使亲和过滤的纯化水平可接近或达到亲和层析； 2nd 膜分离以压差为传质推动力，速度快，易于放大和实现连续化操作; 3rd 制备亲和过滤介质所用的载体一般为水溶性聚合物(如聚丙烯酰胺)或无孔微粒(如聚合脂质体、纳米硅胶)，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快，从而可最大程度地分挥膜分离法速度快的优势. 4th 传统的亲和吸附介质(如琼脂糖凝胶)也可用做亲和过滤介质，此时内扩散传质阻力可能成为分离操作的速度控制步骤。但是，由于膜分离法易于放大，只要保证在吸附过程