8-蛋白质化学6-理化性质与分离分析.ppt

E. coli’s Proteins O’Farrell的蛋白质双向电泳 银染结果 考马斯亮染色为蓝色 毛细管电泳 (Capillary Electrophoresis, CE) 又称高效毛细管电泳(HPCE)，是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行电泳分离，创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988-1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内，由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求，得到了迅速的发展。 high performance capillary electrophoresis apparatus “CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。其仪器结构包括一个高压电源, 一根毛细管, 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 电压：0-30 kV； 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19-10-21 mol/L） 高压电源 （1）0-30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换 毛细管柱 （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差。 （2）规格：内径20-75μm，外径350-400μm；长度=1m 检测器 要求：极高灵敏度，可柱端检测。检测器、数据采集与计算机数据处理一体化。 类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-13-10-15 加二极管阵列，光谱信息 荧光 10-15-10-17 灵敏度高，样品需衍生 激光诱导荧光 10-18-10-20 灵敏度极高，样品需衍生 电导 10-18-10-19 离子灵敏，需专用的装置 蛋白质凝胶电泳的染色 蛋白质条带染色是蛋白质凝胶电泳中一个重要的步骤。目前的方法主要有考马斯亮兰染色、银染、荧光染色、负染等。将考马斯亮兰与BBR相结合进行染色，可以减少染色／脱色的次数，能够提高考马斯亮兰在蛋白质条带上的染色效果。Gallyas Intensifying方法与银染相结合，能提高用银染已经检测到的蛋白质条带的亮度，使蛋白质点之间及其与背景之间更容易区分。将银染与考马斯亮兰结合起来进行染色可以提高同一块胶上微量蛋白质检测灵敏度。对染色方法改进主要集中在如何提高蛋白质染色的灵敏度、操作方便与否、费用是否昂贵等方面。 考马斯亮兰染色Coomassie Brilliant Blue (CBB) Staining 用考马斯亮兰分子上的芳香苯环与蛋白质的疏水区结合，同时其亚硫酸基团与蛋白质的正电荷结合，使蛋白质染出兰色条带。该法简单、快速，是蛋白质电泳检测和定量分析常用的一种方法。但灵敏度不高，检测下限为0.3-1 ?g，背景较高。而且该方法染色强度依赖于蛋白质的特性，碱性蛋白质、低分子量蛋白质在醇、酸固定时，容易从凝胶中洗脱下来。广泛运用的是考马斯亮兰R-250。 改进的考马斯亮蓝染色 对凝胶进行CBB染色以后，用咪唑锌进行负染，白色背景上不仅可以观察到CBB所染的条带，还能看到透明的负染条带，这些负染条带是CBB不能检测到的。快速、简单、重复性好，能够在蒸馏水中保存数月，条带类型也不会消失。灵敏度最低可以检测到1-10 ng的条带。 CBB染色过程中，多余的CBB能够以离子配对的形式与胶相结合，一种叫Bismark brown R (BBR) 的化学物质则能够阻止这种结合。将CBB与BBR相结合进行混合染色，可以减少染色／脱色的次数，并且能够提高考马斯亮兰在蛋白质条带上的染色效果。 J. Jung等将CBB(0.2％)和BBR(0.05％)以1：0.75的体积比进行混合，发现能在20-25 min内完成染色／脱色的过程，对BSA的最小检测量为25 ng 银染 (Silver Staining) 最常用和最灵敏的方法。银离子与蛋白质分子上的巯基或羧基结合，再被还原为自由的银，可使蛋白质条带呈现深棕