第八章 高效液相色谱.ppt

第八章 高效液相色谱（ HPLC） 在已知化合物中能直接进行气相色谱分析的化合物约占15％，加上衍生化的化合物，也不过20％左右。 高沸点、难挥发、热不稳定、离子型化合物、高聚物乃至生物大分子，很难用气相色谱法分析。 在经典的液体柱色谱法基础上，采用高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，引入气相色谱理论后发展起来的柱色谱技术称为高效液相色谱法。 特点：应用范围广，分离效率高，分析速度快，灵敏度高，操作自动化等。 高效液相色谱仪器 高效液相色谱仪器 第一节 高效液相色谱仪 输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理 一、输液系统 作用：输送流动相通过整个色谱系统 压力：150～350×105 Pa。 由于色谱柱很细，填充剂粒度小，柱阻大，必须有很高的柱前压力，才能获得高速的液流 要求：具备较高的输出压力，流量精度高、稳定、范围宽 种类：恒压泵 恒流泵——柱塞往复泵 （二）梯度洗脱装置 等强度洗脱：在一个分析周期中，流动相组成保持恒定 梯度洗脱在液相色谱中的作用相当于气相色谱中的程序升温 梯度洗脱：在一个分析周期中，按一定程序连续改变流动相中两种（或更多种）溶剂的组成和配比，使各组分都在适宜的条件下（k值范围1～10）获得分离 类型：高压梯度、低压梯度 二、分离和进样系统 （一）进样器 1. 注射器 2. 六通进样阀 （二）色谱柱 1. 构造 由柱管（不锈钢）和固定相组成 常规分析柱 2～5mm 10~30cm 窄径柱 1～2mm 10~20cm 毛细管柱 0.2～0.5mm 3~10cm 类型：分析型、制备型 2. 性能评价 柱压、H、n、k、?、R等 柱效：主要取决于柱填料（固定相）的性能和装柱技术 3.预柱（保护柱） 连接在进样器和色谱柱之间的短柱（3～5cm），防止来自流动相和样品中不溶性微粒堵塞色谱柱。 三、检测系统 作用：把色谱洗脱液中组分的量（或浓度）转变为电信号。 要求：灵敏度高、响应快、重现性好、线性范围宽、适用范围广、死体积小、对流动相流量和温度波动不敏感等 通用型检测器 示差折光检测器、蒸发光散射检测器 专属型检测器 紫外检测器、荧光检测器、安培检测器 光电二极管阵列检测器 （三）示差折光检测器 利用组分和流动相的折射率之差，进行检测。 在适当的条件下对所有的溶质都有响应，应用范围宽。 对温度和流速很敏感，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。 示差折光检测器 示差折光检测器 （四）电化学检测器 电导检测器：主要用于离子色谱法 安培检测器：测定能氧化、还原的物质，应用广泛 原理：检测池相当于一个电解池。组分通过电极表面时，当两电极间施加大于该组分的氧化（或还原）电位的恒定电压时，组分被电解而产生电流，服从法拉第定律。 四、数据记录处理和计算机控制系统 色谱管理软件可实现全系统的自动化控制 自动采集和分析色谱数据，色谱工作站是数据采集、处理和分析的独立的计算机软件 第二节 高效液相色谱法的主要类型和原理 固定相 液液色谱、液固色谱 分离机制 基本类型：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱 其他：化学键合相色谱、离子抑制色谱、离子对色谱、亲合色谱、手性色谱、胶束色谱、电色谱等。 一、 液-液分配色谱 化学键合相色谱法 固定相：极性键合相 -CN, -NH2, 或二羟基等键合在硅胶表面 反相键合相色谱法 溶质的非极性部分在与极性溶剂分子间的排斥力的作用下，和键合相的烃基发生疏溶剂缔合； 另一方面，溶质的极性部分受到极性流动相的作用，有解缔合作用。 二、液-固吸附色谱 三、离子交换色谱法 四、离子对色谱法 反相离子对色谱 固定相：C18或C8键合相 流动相：含有离子对试剂的有机溶剂－水溶液 应用 适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型混合物的分离，还可借助离子对的生成引入紫外吸收或发荧光的基团。 五、 离子色谱法 六、空间排阻色谱法 七、 亲和色谱法 第三节 高效液相色谱法的固定相和流动相 采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相为化学键合固定相 非极性键合相 C18 ODS、C8、C1、苯基 弱极性键合相 醚基、二羟基 极性键合相 ?Si(CH2)3NH2、 ?Si(CH2)2CN 化学键合固定相的特点 二、化学键合相色谱法的流动相 选择流动相时应注意的几个问题 2. 混合溶剂的极性和强度 （三）流动相最优化方法简介 优化标准： 实现最难分离物质在理想分离前提下的快速分离 实现最大整体分离效能前提下的快速分离 调节溶剂极性可使样品组分的k值在适宜的范围 例 在一反相色谱柱上，当流动相为30％甲醇和