第四章 高效液相色谱法.ppt

流动相 改善分离主要通过固定相来实现。 流动相的选择原则是： 溶解样品、与凝胶浸润、 与检测器匹配、粘度小。 如四氢呋喃；缓冲溶液 6、液相色谱分离类型及条件选择 了解分析对象 要分析的组分的大致浓度 干扰物质 试样的性质 结构、分子量、酸碱性、溶解性 * * * * * * * 固定波长的紫外检测器结构 可变波长的紫外检测器 二极管阵列检测器 特点 选择性检测器，用于芳烃类化合物的检测 灵敏度高，可检测10-9 g/mL的物质 线性范围宽，104～105 对温度及流动相的改变不敏感，适合梯度洗提 （2）示差折光检测器 原理 以不同物质对光的折射率作为信号源，光源发射的光经透镜聚焦，滤镜分光后成为两束平行光，分别透过样品池和参比池，出射光因发生折射，强度发生变化，反映样品信息。 特点 通用性检测器 灵敏度较低，10-7 g/mL 基线易受温度的影响，不适合梯度洗提 （3）荧光检测器 原理 以样品被激发产生的荧光作为信号，通过强激发光光源经透镜聚焦，滤镜分光后照射于样品上，样品产生的荧光被光电倍增管接收后，依据比尔-朗伯定律确定样品浓度。 特点 选择性检测器。用于蛋白质、氨基酸等生化样品的检测 高灵敏度，比紫外高约一千倍 对温度和流速不敏感，适合梯度洗提 线性范围较小 （4）电导检测器 特点 选择性检测器，对离子型化合物有响应 灵敏度高 受温度的影响大，不能梯度洗提 四、HPLC主要类型及其选择 化学键合相色谱法 液固色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 体积排阻色谱法 1、化学键合相色谱法 分离原理 利用不同样品在流动相和固定相中的分配系数不同实现分离， 为提高分离效果采用极性相反的流动相和固定相， 为防止固定液流失，通过化学键合于硅胶担体。 正相键合相色谱法：固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化合物。 反相键合相色谱法：固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性和离子性化合物，应用最广泛。 固定相 疏水基团：如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等 极性基团：如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。 流动相 正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷为主体，加入质子接受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给予体氯仿，偶极溶剂二氯甲烷 反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇及其混合物等，以水为主体，加入质子接受体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂溶剂四氢呋喃。 溶剂的选择原则 溶剂具有稳定的化学性质 溶剂的选择与使用的检测器要有相容性 溶剂的粘度要小 溶剂的沸点不能太低 溶剂的纯度要高且价格便宜 2、液固色谱法 分离原理 以固体吸附剂为固定相的液相色谱法，根据物质的吸附作用不同实现分离 分配系数即吸附平衡常数 适用于不同极性化合物，同分异构体 固定相 极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等 非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 流动相 硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。 可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂 3、离子对色谱法 分离原理 在流动相中加入与样品极性相反的离子，使其与样品中生成疏水化合物便于分离，避免使用强极性的流动相，提高分离效能。 固定相、流动相和离子对试剂 固定相：多为C18，C8反相键合相 流动相：以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶剂 离子对试剂：四丁基铵正离子、十六烷基三甲基铵正离子，ClO4-，十二烷基磺酸根等 4、离子色谱法 分离原理 试样中的离子与离子交换树脂上具有相同电荷的离子发生交换反应 不同的离子与树脂离子的交换能力不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。 分类： 双柱抑制型：在分离柱和检测器之间加一个化学抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景电导，二是增加被测离子的电导值，改善信噪比。灵敏度高。 单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。 固定相 离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换树脂小球， 阳离子交换：烷基磺酸类 阴离子交换：烷基铵盐类 流动相 双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。 单柱非抑制型：分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等 5、体积排阻色谱法 分离原理 以多孔凝胶为固定相，利用精确控制的凝胶孔径，使样品中不同分子大小的组分得以分离 使用水溶液的凝胶过滤色谱法（GFC），主要用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。 使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的测定 固定相 软质凝胶：交联葡聚糖等，分离生化体系，适于低