第四章 酶的提取与分离纯化 2010.4.12.ppt

第四章 酶的提取与分离纯化 Contents of chapter 4 Contents of chapter 4 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。　 酶的组合分离纯化策略 第二节  细胞破碎 定义: 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化. 一、细胞壁的组成和结构 微生物细胞壁的化学组成和结构 细菌，肽聚糖的网状结构 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质 真菌：细胞壁更厚,低等真菌的细胞壁成分以纤维素为主，酵母菌以葡聚糖为主，而高等真菌则以几丁质为主。 植物细胞壁的化学组成和结构 初生壁，次生壁 具有很高的机械强度 细菌细胞壁结构 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。 酵母细胞壁的结构示意图 真菌的细胞壁 真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 植物细胞壁的结构 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～3μm），富有弹性。由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。 植物次生细胞壁 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。 因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 （一）机械破碎法 通过机械运动所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法，称为机械破碎法。 常用的机械破碎法： 捣碎法 组织捣碎机 研磨法 珠磨 匀浆法 匀浆器 （二）物理破碎法 利用温度、压力、声波等物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，为物理破碎法。 常用的物理破碎法： 温度差破碎法 破碎较为脆弱、易于破碎的细胞 压力差破碎法 高压冲击法、突然降压法、渗透压变化法 超声波破碎法 适合于微生物细胞的破碎 （三）化学破碎法 原理：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 常用试剂：有机溶剂、表面活性剂 如有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿 表面活性剂：特里顿（Triton）、吐温（Tween） （四）酶促破碎法 原理：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法。 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解 第三节  酶的提取 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 提取原则： a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 一、提取方法 1、盐溶液提取 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。 一般采用