第五章 液相色谱.ppt

什么情况下可以用色谱 主要解决混合物的分离问题 样品在过程中不能发生分解聚合或者与色谱系统发生化学反应 样品在色谱体系中必须能够以分子或离子状态分散在两相之间，不能凝结、沉淀或相分离 什么样品适合做色谱 无机、有机气体小分子化合物 各种有机化合物 蛋白质、肽、核酸等大分子物质 不适合做色谱 无机化合物如金属或无机盐：离子色谱、电泳分析以及原子光谱分析； 金属阳离子无机元素：ICP等光谱手段； 同位素：无机质谱； 无机阴离子、各种氧化物及其酸根阴离子：色谱、电泳方法分析 2、液相色谱分析法的发展 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 　　　随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。 2.1 HPLC的特点（一） 流程图 3、色谱分析法简介 　　　液固色谱------以固体吸附剂为固定相，依靠吸附－脱附平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。 　　　特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。 　　　液液色谱------以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非极性固定液为固定相，依靠溶解－解吸平衡实现分离。 　　　特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。 3.1.2　色谱法简介（二） 体积排阻色谱法--------以多孔性凝胶为固定相，借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。 　　　特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。 适用范围：分子量差别较大的样品。 离子对色谱法--------分析离子化的强极性化合物。 亲和色谱法等等 3.1.3 色谱法简介（三） ◆　键合相色谱法简介 键合相色谱-------是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解决固定液的流失问题,是目前用的最多的一种色谱分析法。 根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱法与反相键合相色谱法。 正相键合相色谱------固定相极性强； 反相键合相色谱------固定相极性弱。 3.2.1 色谱柱简介（一） 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。 3.2.2 色谱柱简介（二） 聚合物填料柱------通常为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等. 优点：PH值为1—14均可使用；具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。 　 缺点：色谱柱柱效较低。 其它无机填料柱------如石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。 3.2.3 色谱柱简介（三） 手性柱-------将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外消旋物的广泛分离。如下图： 4、分析方法的建立 5.1 色谱柱的选择： 　　疏水性的样品——反相键合色谱； 　　亲水性的样品——正相键合色谱； 　　生物大分子 ——体积排阻色谱； 　　无机离子化合物——离子对色谱； 　　高分子聚合 ——凝胶色谱； 　　同系物的分离——吸附、分配和键合色谱； 　　同分异构体　—— 双键或取代基异构用吸附色谱； 　　　　　　　 —— 多环芳烃异构选用反相键合； 　　对映异构体 —— 流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。 4.2 流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择 根据分析样品的结构、性质，结