分离分析化学4-2色层分析法.ppt

凝胶层析（gel chromatography）也称： 分子筛层析 分子排阻层析 凝胶过滤 凝胶色谱等 简介 凝胶色谱是以各种多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种技术。 突出优点是：凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。 1、外水体积：指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶颗粒间液体流动相的体积。（Vo） 2、内水体积：指凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相体积。（Vi） 3、骨架体积：指凝胶颗粒实际骨架体积。（VGM） 4、柱的总体积：指凝胶柱所能容纳的总体积。（VA） 5、洗脱体积：指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。（Ve ） 1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出； 2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出； 3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。 流动分离理论是凝胶色谱分离机理的一种理论模型。它把凝胶填料内的孔隙设想成由许多平行的毛细管组成。毛细管的排除效应使体积大的分子不能进入管内，而在管外，流动相流速大于管内。在能进入管内的溶质分子中，较大的溶质分子被流速场集中到管子中心而加快移动，较小的溶质分子因处于管内壁附近而降低了移动速度。其结果是溶质按分子体积大小分离。 1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。 2、稳定工作pH为2－10，强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。 3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 °C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。 4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。 5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。 6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 琼脂糖的商品名称有: Sepharose(瑞典) Bio-gel A(美国) Segavac(英国) Gelarose(丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。 * 将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。 将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。 1．类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。 例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。 * 1．类分离 （1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。 选用Sephadex G-25凝胶，分离范围1 000～5 000。 2．分级分离 分开分子量不很悬殊的大分子物质。 选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，