高效液相色谱4.ppt

保留值的重现性 色谱柱问题与解决方案 保留值与分离度重现性不好 色谱柱问题与解决方案 不同生产商的同类型柱（如C18）往往在保留值与分离度方面差异显著 谱峰拖尾 谱峰拖尾 例：日本YMC公司液相色谱柱及其产品YMC and HPLC Columns YMC公司简介 --- 高压液相色谱填料和色谱柱著名的生产制造商 　　　YMC公司是世界上主要的液相色谱柱和纯化分离填料生产制造厂商之一，具有数十年的产品开发和生产的经验。许多世界著名的液相色谱仪厂商，如美国Waters公司和日本岛津制作所等，均选用YMC液相色谱柱为其液相色谱仪配套，YMC产品在全世界要求高品质的液相色谱用户中享有崇高的声望。在北美YMC的产品已经并入世界著名液相色谱仪器生产公司美国Waters集团，全部产品由Waters公司负责销售，其产品优越的性价比深受广大用户的信赖。 高效液相色谱技术与应用 （四）高效液相色谱柱 本节主要内容 色谱柱与柱填料的选择性 色谱柱的性能指标 色谱柱问题与解决方案 色谱柱与填料的选择性 柱填料 硅胶填充微粒 多孔聚合物 其它无机填料 大多数用于HPLC分离的柱填料使用硅胶微粒作担体。 实心微球起作用的时表面很薄的外壳，1.5~2.5μm大小 因为快速传质的动力学过程，对大分子有突出的分离效能 表面积小，容量有限，适于分析型HPLC 超小微粒能产生极为尖锐的峰 灌注微粒填料包含孔径达4000~8000à 溶质可通过对流和扩散的共同作用，进入和离开孔结构，减少峰展宽。 柱效与小微粒相当，压力降却小得多 可能更适合大分子蛋白质的制备分离 HPLC一般使用7~12nm孔径的全多孔微粒。 微粒直径约5μm很好地兼顾了分析柱的柱效、反压和寿命。 更小的多孔微粒如3 μm有利快速分离 硅胶填充微粒 硅胶填料的优缺点 良好的物理特性 机械强度高，刚性，高强度使柱反压较低 表面能通过化学改性(修饰)引入种类繁多，具有不同官能团的健合相。 更换溶剂时填料大小不变化(如溶胀) 在高pH时硅胶溶解 表面酸性 酸性强，使碱性样品的保留值增加，峰展宽、拖尾 金属污染：与螯合溶质缝合，引起不对称或拖尾，死吸附 纯度不高的酸性硅胶称A型硅胶：能用于分离中性和非电离的化合物 高纯度弱酸性硅胶称B型硅胶：一般对离子或可电离的化合物，尤其是碱性物质分离较好 多孔聚合物 用于反相HPLC大多数聚合微粒由二乙烯基苯的聚苯乙烯制成 主要优点是pH1~13均可用 很强的疏水保留性 大孔的多孔聚合物对蛋白样品的分离非常有用 强保留的物质可用0.1M的氢氧化钠从柱中洗脱。 缺点是柱效低 在不同的有机改性剂中溶胀程度不同 其它无机填料 石墨碳 保留强，用于分离在C18柱上保留较小的化合物 流动相不会被溶解，可用于任何pH与温度下 缺点是柱效低、极易碎裂。 氧化铝 刚性强，可制成稳定的柱床。 未改性的氧化铝在正相条件下分离弱极性溶质。 担体用聚合相涂层后用于反相 可在pH高达12的流动相中使用 不能用于羧酸样品分离 氧化锆 聚合物涂层的多孔氧化锆微球柱可用于所有已知的HPLC洗脱剂 pH范围1~14，温度高达100℃ 色谱柱的构型 大多数用于HPLC的色谱柱是用一节内壁经高度抛光处理的直不锈钢管，用收缩接头将其与HPLC仪器连接 色谱柱两头用多孔烧结物(滤片)封闭，固定住填料微粒 建立分析方法通常用内径0.46或0.3cm、粒度3~10μm的色谱柱最好 固定相 键合硅胶 　一般通过在担体表面共价键合有机硅烷或沉积聚合物有机涂层。 固定相 键合硅胶 　硅胶担体共价键合硅烷的各种类型 正－十八烷基硅烷（ODS或C18） 固定相 硅胶表面覆盖率 封尾（endcapping） RPC中键合相的保留行为 担体表面积越大，保留值K就越大 样品保留值一般随键合碳链长度增加（C18C8C3C1） 通过选择键合相，可将样品保留值控制在一定范围内，但保留值的变化会随色谱柱填料的表面积与所用硅胶担体类型的改变而变化。 RPC中键合相的保留行为 担体表面积越大，保留值K就越大 样品保留值一般随键合碳链长度增加（C18C8C3C1） 通过选择键合相，可将样品保留值控制在一定范围内，但保留值的变化会随色谱柱填料的表面积与所用硅胶担体类型的改变而变化。 固定相 键合相色谱柱的稳定性 长链更稳定 与键合相类型 流动相pH、缓冲液 在高温、低pH及水比例高的流动相中，硅烷键合相担体上的Si-O-Si键的水解加剧 固定相 空间保护官能团 有空间保护的硅胶基质固定相稳定性高 固定相 高pH值分离的情况 化合物在低pH时不稳定 低pH时，达不到所需选择性 质子化的碱性化合物在低pH时，保留太小 高pH值使柱床塌陷，硅胶基质溶解 固定相 柱填料封尾可减少硅胶基质色谱柱在中等与高pH下的降解 固定相 流动相与操