高效液相色谱8.ppt

高效液相色谱技术与应用 （八）高效液相色谱梯度洗脱 本节主要内容 梯度洗脱的应用 用于常规分析 梯度洗脱用于方法建立 梯度洗脱的原理 梯度与等度洗脱 梯度变化速率的影响 梯度形状的影响 建立梯度分离 选择梯度条件 改变峰间距 调整色谱柱条件 实验问题 梯度洗脱相对等度洗脱的一些不足点： 梯度洗脱更复杂，更难进行新方法建立与常规分析 某些HPLC检测器(如示差折光检测器)不能使用梯度洗脱 每次运行梯度洗脱后需要重新平衡色谱柱，耗时较长 不同设备的分离结果可能不同，所以梯度洗脱法移置时会出现差异 梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂 某些色谱柱/流动相的联合应用不适于梯度洗脱 梯度洗脱的应用 常规的梯度洗脱分离适合于下列样品： 具有较宽的k值范围的样品(即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5k20) 大分子样品(如分子量大于1000，尤其是生物样品) 样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出 溶于弱溶剂的样品稀溶液(如用反相柱分离的样品水溶液) 即使最终有可能使用等度方法，初始试验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立的最佳起点 梯度洗脱用于常规分析 样品的保留值范围 (选择梯度洗脱的一般理由是样品具有较大的保留值范围) 梯度洗脱用于常规分析 大分子样品组分一般采用梯度洗脱分离更好(这类样品的等度保留往往对于流动相组成(B%)的微小改变极其敏感，难于将保留值控制在合适范围内 晚流出组分 梯度洗脱用于常规分析 增强检测灵敏度 梯度洗脱用于常规分析 稀样品溶液可以大体积(等度洗脱也可以进行相似的柱上浓缩，但是由于进样过程中样品与流动相的混合，使样品体积过大，引起榈峰严重展宽) 梯度洗脱的替代方法 用极性较强的反相柱(如氰基柱)通常可以缩小保留值范围。 采用THF作强溶剂 梯度洗脱用于方法建立 首先采用梯度洗脱试验有以下益处： 初始梯度洗脱分离可以近似估计出样品的保留值范围，为后续实验应该选用等度或梯度洗脱提供必要的依据；识别不适于反相HPLC的保留极弱或极强的样品。 若等度洗脱是较好选择，初始梯度实验可为进一步实验提供最佳%B的估计值。若梯度洗脱更合适，则初始实验可为下一步的梯度洗脱估计出开始和终止%B的最佳值 初始梯度实验避免遗漏早与晚流出的低浓度组分 使用等度或梯度分离方法的确定 ΔtR= tRz- tRa 0.5k20时， ΔtR/tG应小于0.4 估计最佳等度条件 估计最佳梯度条件 梯度洗脱的原理 等度分离中的每个峰在穿过色谱柱的过程中，被组成恒定不变的流动相%B所包围，由容量因子k衡量的某一谱峰的保留值在分离过程中保持不变。 在梯度洗脱中，一谱峰在穿过色谱柱的过程中周围的流动相是改变的，该谱峰的即时k值也是在变化的。 等度色谱图中被分离的谱峰通常具有不同的k值，而在梯度洗脱中不同谱峰的有效k值(k*)却几乎相同。 梯度变化速率的影响 梯度变化速率(%/min)的增加类似于等度时%B的增加 梯度k*的增加类似于等度k的增加 梯度范围的影响 梯度范围指梯度起始和终止%B的差值。 初始的试探性实验可进行一次全范围梯度(即5-100%B 梯度形状的影响 线性梯度易于优化，应用于方法建立的初试阶段 非线性梯度有时可适当地改善分离： 同系物或低聚样品，这类样品的分离度一般随化合物分子量和保留值的增大而降低 色谱图中有些区域具有大量重叠峰或少数峰间距较大 色谱图中不同区域变化速率不同的梯度时选择性最佳常不显著 含组峰的色谱 建立梯度分离 基线问题 漂移 梯度洗脱中， 基线向上漂移非常普遍，通常由所用A与B溶剂的紫外吸收差异所致。 与吸收有关的基线漂移可通过运行一次空白梯度加以证实 检测器波长越短，设置越灵敏，这种漂移越显著。 与吸收有关的基线漂移可通过“吸收匹配”来消除(即在A溶剂中加入UV吸收化合物，以增加A溶剂的吸收，使与B溶剂相等，这类化合物包括无机离子如硝酸盐、亚硝酸盐或叠氮化物，小有机离子如甲酸、乙酸，亲水的小分子量化合物如尿素、硫脲、甲酰胺。 梯度洗脱中的第二类基线漂移，可由空白梯度的弯曲基线来识别，最大信号接近50%B，此类漂移由折射率(RI)引起，与检测器流通池和光路设计密切相关，所以可能需要采用不同型号的UV检测器，降低这种漂移。 基线问题 人工峰 进行空白梯度实验时，尤其用短波长UV检测和高灵敏度设置时，色谱图中出现很大的谱峰。 这种干扰通常由与流动相和设备有关的疏水且有UV吸收的杂质引起。 可通过一些简单的实验查出污染源 * * 即使有些时候等度洗脱可行，但用梯度洗脱可能会更好，只要ΔtR/tG0.15时，最好采用梯度洗脱 梯度洗脱的有效保留常数值等于谱峰在柱上迁移至一半路程时的k值，用k*表示，与等度分离一样，它决定样品的分离度和峰宽。 不同峰的k*近似为常数值是反相线性梯度分离的