高效液相色谱9.ppt

高效液相色谱技术与应用 （九）生化样品：蛋白质，核酸，糖类及其有关化合物 本节主要内容 引言 一级结构 生化HPLC的特殊要求 肽与蛋白质样品的分离 反相分离HPLC 离子交换HPLC 疏水作用色谱 低聚核苷酸的分离 离子对HPLC 离子交换HPLC 尺寸排阻色谱法 SEC保留的基础 应用 常见问题与解决方案 蛋白折叠 引言 影响蛋白质构象的HPLC分离条件 HPLC模式(离子交换，反相等) 流动相组成(水相与有机相，pH等) 色谱柱填充料的性质(亲水性与疏水性) 流速(在色谱柱中驻留的时间) 分离温度 一级结构 酸性与碱性氨基酸在肽分子中的比例决定了其净电荷为零时的pH(称为等电点或pI值)，在低于此pH的氛围中，肽将带正电，反之则带负电。 氨基酸和肽分子所带电荷在肽分离中具有重要作用，改变流动相的pH可对其加以控制。 与碱性肽相比， 中性pH时酸性肽的保留值在阴离子交换中较大， 而在阳离子交换中较小。在低pH反相色谱分离时，酸性肽的保留值通常大于碱性肽。 反相分离时，疏水氨基酸对保留值影响较大。 非极性的芳香和脂肪氨基酸侧链导致较大保留，而电离的侧链使保留减小。 低聚核苷酸与核酸 低聚核苷酸(oligos)与核酸的组成就重复单位的种类而言，比蛋白与肽简单，由交替和磷酸盐基团的骨架组成，核酸碱基连接于糖上。 DNA的糖基为脱氧核糖，常见碱基包括胸腺嘧啶(T)，腺嘌呤(A)，胸嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)。RNA的糖基为核糖。而碱基除胸腺嘧啶换为尿嘧啶外，与DNA同。 低聚核苷酸中影响色谱分离的结构特点 分子内碱基对A-T或G-C(发夹圈型)，会引起谱峰展宽或单一低聚核苷酸出峰一个以上。 分子间碱基对(聚集)，尤其是含鸟嘌呤较多的低聚核苷酸，也会导致谱峰展宽，单一低聚核苷酸出峰一个以上。 生化HPLC的特殊要求 色谱柱 孔径：商用柱填料一般至少有两种均孔尺寸可用，60~120A与250~350A。 K与表面积成正比，所以柱填料的孔径大小影响保留值 生化HPLC的特殊要求 粒度大小 与分离小分子一样，生物分子的分析分离最常用的填料是5μm硅胶 灌注型微粒填料孔径非常大(1000A)，主要用于复杂程度较小，对塔板数要求不高的蛋白质样品的制备与分析分离。 生化HPLC的特殊要求 色谱柱的稳定性 不侧倾向于用键合硅胶填料，尤其不用于制备分离 常用糖基质填料(交联葡聚糖Sephadex，琼脂糖等)与聚合物填料(聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯等) 生化HPLC的特殊要求 色谱柱的选择 分离度或将复杂样品分离成为尽可能多的峰的能力差别：SECHIC≈IECRPC。 HPLC使蛋白质榈变性的趋势差别：SECIEC≈HIC≤RPC 样品分子的构象 如某酶的离子交换分离需保存生物活性，则可能需要： 严格的流动相pH范围 有限的有机溶剂浓度 严格的离子强度和/或反离子范围 低温 是否存在辅助因素，特殊金属离子，底物或产物 是否需加入洗涤剂或其它表面活性剂 限定的总蛋白浓度 样品回收：质量和生物活性 生物大分子的回收率较低，活性较差 在分离期间样品部分发生变性 有些样品不可逆地粘附在填料基质上 提高回收率可能过 缩短运行时间 增加样品重量/色谱柱体积的比值 用活性低的基质作填料(比如琼脂糖) 样品预处理 样品溶剂：进样前，样品必须完全溶解、无颗粒物，样品溶剂应与色谱分离流动相兼容。 样品预处理 表面活性剂：常用于增加生化样品的溶解度，保持生物活性或预防聚集。 两性和中性表面活性剂(Triton X-100,X-114, Zwittergen,辛糖苷)对RPC干扰较小 样品溶解 无论样品来源如何都应完全溶解，注意除去颗粒状杂质。 在分子量的肽或蛋白质，应避免剧烈振摇或搅拌，否则易产生大量泡沫，使蛋白变性 样品检测 不同的低聚核苷酸具有相似的UV光谱，因而在最大吸收波长处(250~260nm)能够检测嘌呤碱与吡啶碱。 可于210~225nm处检测肽，此处酰胺键的吸收很强。 氨基酸的芳侧链可于254~260nm(苯丙氨酸和酪氨酸的吸收处)或270~290nm(酪氨酸和色氨酸的吸收处)进行检测 色氨酸是唯一具有显著、天然荧光性质的残基(激发波长280nm,发射波长325~350nm)。 肽与蛋白质样品的分离 RPC的分离能力较强，最常用于肽与蛋白质的分析分离。 用RPC分离生物大分子的一个特点是改变有机溶剂浓度即可较快地改变保留值(k):改变0.1%B能使30000Da蛋白的k变化20%，这一特点使等度条件或变化较慢的梯度保持稳定的保留时间较困难。 IEC、SEC、HIC与亲和分离都能用于分离天(具有生物活性的)蛋白质。 肽与蛋白质样品的分离 RPC方法建立的通用法则 选择初始条件 优化保留值 优化选择性 优化柱条件 肽与蛋白质样品的分离 RPC常