高效液相色谱11.ppt

高效液相色谱技术与应用 （十一）使用HPLC进行定量分析及制备分离 定量分析 准确度，精密度和线性范围 准确度的定义为测量值与真值接近的程度。 精密度是指同一样品多次测量结果的重复程度。这种重复程度包括使用不同的仪器、操作人员、样品制备、实验室等在一天人或经过数天所得测量结果的重现性。 方法的线性是指响应值与样品浓度的校正曲线近似成一直线的程度，或者数据满足线性的程度 y=mx+b 定量分析 检测限和定量限 被测物最小可检测量［常称做检测限(LOD)］指能被可靠检测的最小浓度。LOD与系统的信号和噪音有关，通常被定义为信噪比(S/N’)至少为3：1的峰。 最小定量限［亦常称为定量限(LOQ)］要求S/N‘比值至少为10。 最大定量限是指使用该定量方法能够可靠测定的最大浓度。最大定量限通常由检测器的线性范围决定。 定量分析 信号的测量 噪音：指没有被测物的情况下基线信号值的不稳定程度。有三种基本类型 短期噪音，可由许多因素引起，包括检测器噪音、泵系统的脉动以及积分系统的电子噪音等 长期噪音，可由外在因素或系统本身问题引起。包括 定量分析 峰高 测定检测器对一化合物响应的最简单方式是测定其信号峰的高度，这种峰测定法对痕量分析较好。 定量分析 峰面积 峰面积是HPLC中使用最广泛的定量技术。分离良好的峰面积可定义为由峰开始到峰终止的时间内信号响应积分值。 峰面积一般用积分仪或计算机数据系统计算。 定量分析 峰高与峰面积定量 只要使用适宜的校正方法，峰高与峰面积均可用于HPLC定量。 定量分析 定量方法 定量的四种主要校正技术是峰面积归一化法、内标法、外标法及标准加入法。 完成一次运行并地色谱图中所有有意义的峰进行积分后，便可计算出总的峰面积。任一峰的面积百分比均可视为归一化的峰面积。 定量分析 定量方法 外标校正法，确定未知榈浓度的最常用方法是用外标物质作出校正曲线。 定量分析 定量方法 内标校正法，在校正溶液和样品溶液中加入内标。物。内标是不同于被测物的化合物，但在分离中能与被测物良好的分开。 定量分析 定量方法 标准加入法：理想的校正标准应该在空白基质中制备，以对实际样品提供最好的校正。不过在某些情况下，不可能制备有代表性的标准溶液，即它已含有被测物，这种情况下，可用标准加入法为定量分析提供校正曲线。 将不同重量的被测物加到样品基质中，开始时在基质中即已含有未知浓度的被测物。将标准加入的校正品浓度响应值的曲线外推至零浓度，即可定义出未添加样品时的初始浓度。 定量分析 定量误差的来源 定量分析 痕量分析 定量分析 痕量分析 样品制备，在某些情况下，样品可以直接注入HPLC柱中而无须前处理。然而多数情况下，痕量分析的样品在最终HPLC分析之前必须经过某些处理的。预富集样品中被测物的方法包括：固体萃取，液-液萃取、过滤、组合柱和柱反冲技术。 定量分析 痕量分析 柱分离度 痕量组分的定量分析应采用峰高法 提高痕量分析灵敏度的的折中办法昌用短高效柱，产生极尖的色谱峰且能使被测组分达到所需分离度。 定量分析 痕量分析 进样：在痕量分析中，为使灵敏度最大，应尽可能加大进样量。 若样品量非常有限，可以有小内径的色谱柱，以使检测灵敏度大大提高。 如被测物的溶剂较流动相弱，注入色谱柱的样品体积往往可以很大。这样，被测组分在柱入口处富集，有助于提高某些被测物的灵敏度。 定量分析 痕量分析 检测：在痕量分析中广泛使用的HPLC检测系统有UV、荧光、电化学和质谱。 荧光和电化学EC检测器比UV检测灵敏(高达1000倍)，且选择性更强 EC检测灵敏度优于荧光检测，但选择较差 定量分析 痕量分析 EC检测灵敏度优于荧光检测，但选择较差 HPLC制备分离 引言 引言 建立制备HPLC分离方法 优化制备HPLC条件 优化制备HPLC条件 * * 基线漂移被认为是一种特殊类型的长期噪音，即使在比较完善的方法中也不可避免。 优点 * * *