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图书馆室内空间布局公共危机管理论文 ［摘要］目的：在外源抗原表位表达载体系统中构建并表达乙型肝炎病毒 HBV 抗原表位，并对其诊断敏感性进行评价。方法：人工合成编码HBV“a”抗原决定簇表位中24个氨基酸 S124147 的寡核苷酸序列，克隆入外源抗原表位表达载体系统FHVRNA2I3位点，构建重组质粒，在原核pET系统 BL21细胞 中表达。通过ELISA和Westernblot检测表达产物的抗原性，并以表达产物为包被抗原,通过ELISA和Westernblot检测58份乙肝患者血清抗HBs。结果：嵌和蛋白可与抗HBs特异性结合，其ELISA检测抗HBs阳性率为77.5%，Westernblot的为68%，而对照试剂盒的为62%。结论：在外源抗原表位表达系统中表达的HBV重组抗原表位具有良好的抗原性，有诊断应用价值。 ［关键词］HBV;抗原表位;抗原性;FHVRNA2载体系统 乙型肝炎病毒 HBV 是乙型肝炎的病原体，并引起慢性肝炎和肝硬化，而且与肝癌的发生密切相关。迄今，对HBV感染最有力的预防和控制措施，仍是发展疫苗。FHVRNA2载体系统［1］是一个以昆虫小RNA病毒flockhousevirus外壳蛋白为载体的新型抗原表位表达载体，此系统中表达的载体蛋白可自动组装成病毒样颗粒，使插入的外源抗原表位可以暴露在颗粒的表面，保持天然构象和免疫学特性。本研究拟将HBVa抗原表位插入到FHV外壳蛋白上，并对其抗原性及诊断意义进行了研究。 1材料与方法 1.1细胞重组质粒DNA大肠杆菌DH5α用于重组质粒pETEDNA的克隆和扩增。大肠杆菌BL21 DE3 用于重组质粒pETEDNA的表达。质粒DNA在含200μg/ml氨苄青霉素的LB或TB培育中生长，FHVRNA2载体系统即重组pETFHV构建见［1］。 1.2HBV抗原表位及重组pETE的构建和表达 1.2.1HBV抗原表位及重组pETE的构建人工合成HBV特异抗原表位E 氨基酸序列：124CTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNC147 寡核苷酸序列：正向5GATGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGC3’；反向3CTACGTGCTGAGGACGAGTTCCGTTGAGATACAAAGGGAGTACAACGACATGTTTTGGATGCCTACCTTTAACG5’，两端为Bsu36I识别位点，与经Bsu36I作用后的重组pETFHVDNA混匀后置室温连接2h,转化DH5α细胞，接种LB平板 200μg/mlAmp 培养。重组质粒pETEDNA经酶切筛选并经DNA序列测定。 2.2携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达重组pET系统中，嵌和蛋白的表达受T7启动子的控制［2］。BL21经重组pETEDNA转化后，在TB培养液中37生长16h～18h,细胞经4000r/10min离心沉淀,用超声裂解缓冲液悬浮，超声裂解，裂解液经离心，弃上清，沉淀 包涵体 用8mol/L尿素溶解。 1.2.3SDSPAGE及Westernblot分析方法见前文［1，3］，3，3二氨基苯胺四氢盐酸 DAB 底物试剂为AMRESCO公司产品;第二抗体辣根过氧化物酶 HRP 结合物购自华美公司。 1.3HBV重组抗原表位诊断意义评价 1.3.1ELISA检测血清样本固相ELISA检测如前文所述［1］，以纯化的嵌和蛋白为包被抗原，每孔100μl 含1μg纯化嵌和蛋白 ，检测58份乙肝患者血清中抗HBs，与抗HBsELISA检测试剂检测结果比较。阳性判断标准为 检测血清A492底物对照A值 / 阴性血清A492底物对照A值 2.1。邻苯二胺二氢盐酸 OPD 购自AMRESCO公司；第二抗体辣根过氧化物酶 HRP 结合物购自华美公司；乙肝患者血清由昆明市传染病医院收集;抗HBsELISA检测试剂盒购自上海科华公司。 1.3.2HBV重组抗原表位Westernblot检测血清样本方法见前文［3］，检测了58份乙肝患者血清样本。 2结果 2.1携带HBV抗原表位的嵌和蛋白的表达FHVRNA2cDNA载体系统即重组pETFHV构建见文献［4］，其编码产物是FHV外壳蛋白，三维立体结构已得到精确测定，其上有6个可供外源抗原表位插入的位点［5］ 见图1 。应用该系统，我们将人工合成HBV抗原表位寡核苷酸序列插入到重组pETFHVDNA上，构建携带HBV抗原表位的重组质粒pETE，经Nsi和Nco双酶切筛选 见图2 和DNA序列测定无误后转化BL21细胞，高水平表达嵌和蛋白。经SDSPAGE和考马斯亮蓝染色 见图3 和Westernblot 见图4 分析