实验电泳技术分析.ppt

实验二 电泳技术 电泳的基本原理 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。 带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。 是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。 二.基本原理 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 二、泳动度 设一带电粒子在电场中所受的力为F，则 F=QE （Q为粒子所带电荷，E为电场强度） 根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的阻力F’为： F’=6πrηv （v为分子移动速度；r为分子半径；η为介质黏度） 当分子达到动态平衡时， F= F’ 即 QE= 6πrηv 移项得 v/E=Q/ 6πrη v/E表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率，也称电泳速度，以?表示。 因此上式也可表示为： ?=Q / 6πrη 从上式可得到以下结论 带电粒子在电场中的移动与: 粒子大小有关，颗粒直径愈小愈快 粒子的电荷有关，电荷愈多愈快 粒子的形状有关，愈接近球形愈快 三、影响迁移率的因素 1.电场强度 电场强度是指每厘米的电位降 凝胶两端距离20厘米，电压降200伏特，电场强度为10伏特/厘米 电场强度越高电泳速度越快 2.溶液的PH值 PH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少 3.溶液的离子强度 缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢 一般在0.02-0.2 4.电渗现象 在电场中液体对固体支持物的相对移动 纸或纤维素带负电荷，使其接触的水溶液带正电荷，向负极移动。 应尽量避免选用有电渗作用的支持物 四、电泳的分类 按电泳的原理来分，可分为二类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 支持物物理性质:滤纸及其他纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、粉末电泳、线丝电泳 支持物装置形式分类：平板式电泳、垂直板式电泳、连续电泳、圆盘电泳 按pH的连续性分类：连续pH电泳、非连续pH电泳 琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质 琼脂糖凝胶电泳 特点 1.具有大量微孔 2.具有较高的机械强度 可以在1%或更低浓度下使用 3.无毒，不需要催化剂 4.具有热可逆性，低熔点琼脂糖回收样品容易 5.生物中性，与别的生物材料结合性低 6.具有高灵敏度放射自显影 7.胶凝温度34-43℃ 熔化温度75-90℃ 低熔点琼脂糖胶凝温度低于30℃ (融化温度高于30 ℃) 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。 优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。 分类 聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和双向电泳等类型。 二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶