实验方法AFLP实验操作指南.doc

AFLP实验操作指南 实验操作流程 DNA样本的准备 把DNA样本用紫外光（或荧光）分光光度计精确的测取浓度，然后将其稀释成浓度为50ng/ul，体积为50ul的溶液，如果DNA样本不多，在保证浓度的情况下体积可以适当减少。 DNA酶切 反应体系 成 分 体 积（ul） 双蒸水 11.4 缓冲液（Yellow buffer） 4 EcoRI (10u/ul) 0.5 Mse I (10u/ul) 0.1 模板DNA（50ng/ul） 4 总体积 20 反映程序 37℃反应3个小时，最后保存于4℃。 检测 取4－6ul酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。 琼脂糖电泳用6×loading buffer： 名称 用量（武汉） 用量（广州） Ficell 400 （蔗糖） 12g 40g EDTA(0.5M PH=8.0) 12ul 10% SDS（十二烷基四磺酸钠） 6ml Bromphenol Blue（溴酚蓝） 25mg 25mg Xylene Cyanole FF（二甲苯青FF） 25mg 25mg ddH2O add to 100ml 100ml 连接接头 接头的制备 按公司说明书将引物单链稀释成高浓度(一般是5OD稀释成1650ng/ul)溶液储存于－20℃冰箱。 取部分引物单链稀释成100uM/l，然后两条正反单链混合，体积比如下： 10ul EcoR1正链、10 ul EcoR1反链和180ulTE混合成200ulEcoR1接头； 100ul Mse I正链、100 ul Mse I反链混合成200ul Mse I接头。 c、反应程序： 95℃下5min，65℃下10min，37℃下10min，25℃下10min，保存于4℃。最终储存于－20℃冰箱。 连接反应体系 成 分 体 积（ul） 双蒸水 7.6 反应缓冲液（T4DNA连接酶自带） 2.5 EcoR1接头 1 Mse I接头 1 T4DNA连接酶（5u/ul） 0.4 酶切反应后溶液 12.5 总体积 25 反应程序 21℃保存过夜。附：酶切和连接之间不要停止。 稀释 按1：10的比列稀释，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于－20℃备用。实验进行到此处可以暂停。 预扩增 反应体系 成 分 体 积（ul） 双蒸水 10.3 缓冲液（10x Tag酶自带） 2 dNTPs(10Mm) 0.4 EA00(50ng/ul) 1 MC00(50ng/ul) 1 MgCl2(25mM/l)( Tag酶自带) 1.2 Tag聚合酶（5u/ul） 0.1 稀释后已连接DNA模板 4 总体积 20 反映程序 a、94℃ 2min b、94℃ 30s c、56℃ 1min d、72℃ 1min e、重复b～d 25次 f、72℃ 5min g、保存于4℃ 稀释 取部分预扩增后溶液按1：25的比例稀释(稀释比例可以自己适当调整)。将已稀释的和未稀释的保存于－20℃储存。实验进行到此处可以暂停。 检测 取未稀释的预扩增产物4－6ul进行琼脂糖电泳检测。 选择扩增 反应体系 成 分 体 积（ul） 双蒸水 1.6 缓冲液（10x Tag酶自带） 1 dNTPs(10mM) 0.2 EA--(15ng/ul) * 2 MC--(15ng/ul) * 2 MgCl2(25mM/l)( Tag酶自带) 0.6 Tag聚合酶（5u/ul） 0.1 预扩增稀释后模板 2.5 总体积 10 *:EA--,MC—后面两个碱基因不同引物对而不同。 （2） 反应程序 a、第1个循环：94℃ 4min, 94℃ 30s, 65℃ 1min, 72℃ 1min； b、第2～13个循环：94℃ 30s, 65℃ 1min, 72℃ 1min（退火温度每隔一个循环降低0.7℃）； c、第14～36个循环：94℃ 30s, 56℃ 1min, 72℃ 1min； d、72℃ 5min, 4℃保存。 6．变性 （1） 变性剂（Loading buffer）配方 组 分 体 积 去离子甲酰胺（Deionized Formamide） 50ml EDTA(0.5M PH=8.0) 1ml 二甲苯腈FF(Xylene Cyanole FF) 0.125g 溴酚蓝（Bromphenol Blue） 0.125g 变性 将3/4体积（或者1/2即可）的变性剂加入PCR反应产物，95℃变性5min，立刻保存于4℃或置于冰上直到上样电泳。