激光扫描共聚焦显微镜(研究生).ppt

（三）光学系统（显微镜） ⑴、倒置荧光万能显微镜 ⑵、显微镜上的外接接口 ⑶、荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达 ⑷、荧光镜座要装有防振动装置 ⑸、装有光路转换装置 ⑹、配备高数值孔径的油浸或水浸物镜 ⑺、载物台支架和附件的配置 (10)、≥4位显微镜荧光滤色片组，置换方便，覆盖紫外和可见光波长 ⑼、荧光显微镜的参数要与光路系统、计算机控制软件系统相匹配 ⑻、汞灯光线的强度可调 荧光源 单光子激励（左），多光子激励（右） 激发荧光能量图 单光子（λ1） 单光子（λ2） 双光子（λ2） 单、双光子激发产生荧光过程的示意图 荧光 荧光 荧光光谱 分隔发射的荧光 Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters （四）计算机系统 控制硬件的软件功能： ①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光挡片位置。 应用软件功能（图象处理、数据分析、生物学应用等）： ①多通道叠加，三维重建，旋转，生成AVI文件，Average拍摄模式提高信噪比；②荧光强度动态分析，动态显示，Ratio值测量（钙离子等）；③FRAP/FLIP；④线性光谱拆分，自定义染料光谱数据库，背景扣除；⑤图像调节 亮度，对比度，Gamma；单个通道分别调节或多个通道同时调节；⑥图像处理：旋转，裁剪，多种滤镜（Kirsh/Laplace/Low pass/Median），添加标尺，箭头，文字等；⑦图像分析：直方图，距离，强度，强度断面分布；⑧VBA模块：宏功能，可以录制，编辑，回放，实现自动操作；⑨多种视图：1D，2D，正交视图，图片叠加等；⑩光谱分析具有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能量共振转移）软件包。 三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤 （一）样品制备 1．组织切片标本 实验标本要求单层，并能很好地贴附在样品池中。所以，组织标本无论是石蜡切片还是冰冻切片，均为越薄越好。 2．细胞标本 细胞种类和纯度，细胞密度和形态。 3．承载细胞的器皿 Petri皿和玻片。 （二）荧光探针的选择 标记生物样品的探针大约分为： 1）蛋白质、单糖和多糖探针； 2）细胞器探针； 3）核酸探针； 4）细胞活性探针； 5）膜和受体探针； 6）细胞膜电位和细胞内pH探针； 7）金属探针； 8）分子的特殊基团结合探针； 9）其他 （4）、按软件要求设置有关参数，进行观察和分析。 （三）仪器使用步骤 （1）、选择激光器类型 （2）、选择相应的滤片 （3）、根据实验目的选择适当软件 Xy观察模式的图象获得 设置染色方法 显微镜和扫描的配置 设置物镜放大率 设置变焦率为1x 设置所需通道 设置最高扫描速度 设置xy观察模式 执行重复扫描 校正对于确定z位置观察所需复合的各部分条件 设置观察范围 校正图象亮度 设置较低的扫描速度 重新校正图象亮度 停止重复扫描 获得图象 储存图象 1） DNA用Hoechst33342标记（蓝）， 2）细胞膜用 NBD-PC染色（绿）， 3）线粒体用Mitotracker标记（红） 三重荧光染色图谱：活HT细胞 1、“更多信号！” 1）、 通过减慢扫描速度 2）、 使用“平均”方法 3）、 增加发射滤镜的带宽 4）、 加大针孔直径； 注意：光学切片的厚度也会相应地增大。 5）、 增大激发能（激光功率）； 注意：漂白效应、饱和效应和光毒效应。 如何改善图像质量 3、“更可靠！” 1）、使用多轨 2）、提供预定义配置。 3）、可同时定义和使用任何形状的多个研究区。 2、“更多细节！” 1）、使用较高数值孔径 (NA) 的物镜 2）、增加“帧大小” = 每条线的像素值 + 每帧的线条数 3）、优化扫描焦距 (Z) 4）、增加动态范围 * * 生物物理教研室 陈丽娜 激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM） 授课内容 一、LSCM的发展与现状 二、LSCM的成像原理及组成 三、LSCM的使用步骤 四、LSCM的基本功能 五、LSCM在生物医学领域中的应用 1957年，Marvin Minsky提出共聚焦原理； 1978年，Brandengoff在高数值