分子生物学实验方法.ppt

什么是Real Time PCR? Real Time PCR的数学原理 Real Time PCR的数学原理 Real Time PCR的数学原理 Ct值与模板的关系 Real Time PCR的化学原理 Real Time PCR的化学原理 Real Time PCR的化学原理 TaqMan?探针 Real Time PCR的化学原理 TaqMan?探针 Real Time PCR的化学原理 PCR反应的构建 Real Time PCR的化学原理 SYBR? Green 法 Real Time PCR的化学原理 SYBR? Green 法 Real Time PCR的化学原理 SYBR? Green 法 Real Time PCR的化学原理 SYBR? Green 法 Real Time PCR的化学原理 SYBR? Green 法 Real Time PCR的化学原理 SYBR? Green 法 Real Time PCR的应用 实时PCR分析 Real Time PCR的应用 终点分析 等电聚焦电泳（IEF）原理：利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。 SDS原理：SDS带大量负电荷，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速率和距离完全取决于其相对分子质量而不受其所带电荷的影响，不同相对分子质量的蛋白质将位于凝胶的不同区段而得到分离。 步骤 （Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通过温度梯度优化退火温度） 用λ噬菌体建立DNA文库示意图 其他载体： bacterial artificial chromosome (BAC) p1 artificial chromosome (PAC) yeast artificial chromosome (PAC) 5.3 RNA基本操作技术 总RNA的提取 mRNA的纯化 cDNA的合成 cDNA文库的构建 基因文库的筛选 5.3.1 总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 5.3.2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。 5.3.4 基因文库的筛选 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有： 核酸杂交法 PCR筛选法 免疫筛选法 核酸杂交法 PCR筛选后稀释 PCR筛选后稀释 PCR筛选后稀释 PCR筛选法 免疫筛选法 5.4 基因克隆技术 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便是属于同一克隆。 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 在分子生物学上，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 5.4.1 RACE技术 RACE（rapid amplification of cDNA ends, cDNA末端快速扩增）是一种获得转录本5‘或3’未知序列的方法。它根据已知序列设计基因片段内部特异引物， 用cDNA进行