TALENs的靶向基因修饰技术易懂版.ppt

简介 Cas9 锌指核酸酶技术 (ZFN) 转基因技术 RNAi技术 生物应用模型构建 基因组靶向修饰 （TALENs） 普通的基 因敲除 什么是基因敲除？ 是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物（表型），推测相应基因的功能。 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。 基因敲除的技术基础 基因敲除 胚胎干细胞（ES）分离 体外培养技术 1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。 基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。 交叉互换 基因敲除的技术基础 利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤 构建重组载体 表型研究 获得ES细胞 鉴定 筛选阳性细胞 同源重组 选择纯合子 TALEN基因敲除技术 TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ） 转录激活子样效应因子核酸酶,, 科学家发现天然的TALENs最初是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的，将它应用于基因修饰方面，使它成为了一种崭新的分子生物学方法. TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。  2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。  3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。 TALEN基因敲除技术 每周 人们可以对基因组的特定位点进行各种遗传操作, 包括基因打靶、基因定点插入、基因修复等, 从而能够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰。 TALENs可识别并结合特定的 DNA 序列, 并通过切割这一序列的特定位点造成DNA的双链断裂(DSB) 细胞利用天然的DNA修复过程非同源末端结合（NHEJ）导致DNA断裂处碱基的变异，造成翻译蛋白的移码突变，从而不能产生正确的蛋白质， 即最终实现基因敲除。 技术原理 TALEN基因敲除技术 应用 TALENs 作用机制 结构及其构建 TALEN基因敲除技术 TALE蛋白能识别并结合特异的 DNA 序列， Fok I 则可通过二聚体化产生核酸内切酶活性, 从而在特定的位点切断DNA序列，造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。 TALENs结构 TALE蛋白的DNA结合结合域 Fok I 核酸酶的切割结构域 TALENs结构的构建 TALE模块识别DNA的机制在于不同的双连氨基酸残基（ＲVD）能够特异地分别识别A、T、C、G 4 种碱基中的一种。 通过对天然TALE 的研究发现，有20多种不同的ＲVD可以特异性的识别碱基，其中 Asn /Ile( NI)识别碱基A; His /Asp( HD)识别碱基C; Asn/Gly(NG)识别碱基T; Asn /Asn( NN)识别碱基G/A。 ＲVD 的第1 位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到稳定ＲVD 的作用; 第2 位氨基酸则直接与DNA 的碱基特异识别 TALENs结构的构建 TALE是由12和13以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位双连氨基酸残基 (RVDs)是靶向识别的关键位点，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基,这样就产生了一连串的识别序列。 TALENs结构的构建 TALENs结构的构建 将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。 TALENs的作用机制 将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA， 形成DSB（D