HPLC方法建立和优化详解.ppt

3.2色谱柱与塔板数的关系 色谱柱的塔板数越高，柱效越高，分离效果越好。 理论塔板数的计算： 3.3好色谱柱应具备的性能 好的峰形 ? 尤其对于碱性化合物, ? 可以不加额外的流动相添加剂 ? 减小拖尾因子以提高分离度和定量准确性 高的柱效 ? 1.8um,3.5um和5um，不同的粒径可以满足任何分离的柱效要求 ? 柱效N – 采用柱效进一步优化分离度 好的选择性 ? C18是最受欢迎的键合相，且适用于大部分化合物的分离 在较宽的流动相范围内均可使用 ? 简化方法开发； 适于更多的应用 出色的重现性– 不同批次的色谱柱都有很好的重现性 好的使用寿命– 至少能分析1000 个样品 3.4保证柱寿命和性能良好 1.针对不同的样品选择合适的填充柱 2.减小压力波动，避免猛烈撞击 3.溶剂和样品严格过滤，使用保护柱和在线过滤片。 4.间断性地用强溶剂冲洗柱子：正相用氯仿/异丙醇＝1：1；反相用甲醇 5.复杂样品进行前处理，尽量减少无谓的强滞留成份和微粒 6.不要超过柱子使用的PH值范围，一般2-7，防止键合相流失 7.不用的柱子要冲洗掉里面的缓冲液，用乙睛保存，避免高浓度的水和醇类。 3.5色谱柱问题及解决办法 保留值与分离的重现性 1.选择色谱柱时，应考虑其化学性质 2.在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应， 尽量减少谱峰拖尾。 3.保证温度，流速，压力和溶剂成分的恒定。 4.流动相上机要脱气 5.保证上样不超载 谱峰拖尾 柱外效应 4.样品分离的系统方法 充分用已知样品结构确定以哪种方法开始 普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他 观察流动相条件改变时色谱峰的移动 根据变化的方向及大小决定下一步干什么 改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！ 色谱柱的改变影响最大 4.1 分离前的准备 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品 4.2 首先要了解的内容 分析前要知道： Ⅰ 灵敏度的要求有多高? Ⅱ 样品的本底是否很复杂? Ⅲ 有多少组份要分析? Ⅳ 对分析的精确度、准确度等有多高要求? Ⅴ 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离的目的和要求： Ⅰ 要分离（即制备）的样品量有多大? Ⅱ 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? Ⅲ 是否需要保持生物活性? Ⅳ 对分离产物纯度的要求有多高? Ⅴ 纯度或活性的鉴定如何完成?灵敏度的要求有多高? 4.3 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 4.4 尽量采用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 4.5 反相色谱的方法开发 开发过程实例 色谱条件∶ 色谱柱：C18，4mm×30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben) 反相色谱条件的改变 改变容量因子 K‘ 改变色谱柱 改变选择性a：通过改变流动相改变选择性 4.6离子型化合物的分离方式 使用离子交换柱∶离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法 加入“对离子”，使样品呈中性 4.7 离子抑制色谱 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内 4.8 离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离