WesternBlotting技术课件.ppt

Western Blotting实验技术 定义 印迹法（blotting）：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探针反应来检测样品的一种方法。 Southern Blot ：1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法。 实验目的 检测一个基因的表达产物是否正确 -- 定性 比较表达产物量的相对变化 -- 半定量 基本流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本流程 制备流程 细胞破碎 1、液氮研磨法 2、机械匀浆法 3、超声波处理法 4、反复冻融法：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐 浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学裂解法：去氧胆酸钠、SDS 6、酶解法：细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理；植物 细胞壁可用纤维素酶处理。 蛋白提取 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。 细胞裂解液（RIPA）： 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，0.1% SDS，1%NP-40，0.5% 去氧胆酸钠，1 mmol/L PMSF，2μg/mL Aprotinin，2μg/mL Leupeptin（使用前加），pH7.5 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、 丙酮和丁醇等。 冰上操作 蛋白定量 蛋白上样量需达到一定的范围 保证开始实验的总蛋白量是一致的 蛋白定量原理 1. BCA（ bicinchoninic acid ）法在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，此物在562nm波长处有最大吸收，颜色深浅与蛋白含量成正比。 2. Bradford法考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处。 3. Lowry法 蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生蓝色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。 蛋白定量原理 4. 双缩脲法当需要快速，但不很准确的测定中，常使用双缩脲法。原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。 5. 紫外吸收法蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。 基本流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）SDS凝胶配制 （2）样品处理： 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋白上样缓冲液，沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 （3）上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到胶加样孔内即可。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳(50-60V)，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳（100-120V）。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： 浓缩效应：样品中蛋白质被浓缩在浓缩胶和分离胶的界面。 电荷效应：等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同。 分子筛效应：分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同。 转膜 转膜方法 毛细管印迹法 滤纸、凝胶、膜、滤纸 重物压住 毛细作用使缓冲液流过凝胶，将蛋白质带到膜上 效率低（10％～20％） 电泳印迹法 用有孔的塑料或有机玻璃板将凝胶和膜夹成“三明治”形状 湿转法、半干法 转膜 湿转法： 将膜、胶叠层浸入缓冲液槽中然后加电压； 胶在负极，膜在正极； 慢，需要大体积冰预冷缓冲液； 适用于分子量较大的蛋白； 半干法： 用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽； 胶在负极，膜在正极； 快（15～45min）； 适用与小分子量蛋白； 转膜步骤（湿转法） 1、电泳完毕后，将膜和滤纸裁至与胶相同大小，并在胶上裁去一角做标记； 2、将胶、膜、滤纸浸泡在转移缓冲液中平衡15min-30min（PVDF需先在100%甲醇中浸泡数秒钟）； 3、打开夹板使黑的一面保持水平，按海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵垫的顺序叠放； 4、赶走气泡后合起夹子。（膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路）将夹子放入转移槽中，夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。 5、冰上 100V 350mA转膜1h，或30V 90mA转膜过夜。 小型Trans-Blot 转印槽 半干转印仪 影响转膜效