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ok 第一步：SDS凝胶电泳，使待测样品中蛋白分子按分子量大小在凝胶中分成条带。 第四步：利用酶标二抗（AP or HRP）与底物显色或通过膜上颜色或X底片上曝光的条带来显示目的蛋白（半定量）。 流程 样品处理 提取蛋白（膜蛋白、浆蛋白、核蛋白） 亲和层析 样品处理 蛋白定量（BCA 、Bradford、Lowry、 nanodrop） 样品处理 将样品蛋白稀释至同一浓度并添加上样缓冲液（loading buffer疏水性追踪染料）热变性 以溴酚蓝为染料，DTT可使蛋白质分子的链内二硫键并摧毁残留二级结构，通过二硫键连接的各蛋白亚单位彼此分离 成胶机制 转膜 湿法 ECL化学发光 Analysis of protein samples by SDS polyacrylamide-gel electrophoresis and Western blotting 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP) HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用 Western Blot一般都选择酶促作为检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法，如化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen。前者灵敏度很高,灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。 原理 底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来红（暗匣，红光下操作），待其发光后在暗室中将X光片覆盖在膜的上面根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干 注意：发光法检测的时候曝光时间要恰到好处，过短会导致曝光不彻底，影响条带亮度，过长会导致荧光信号衰弱，也会使背景颜色加深。 Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent Membrane Primary Antibody Secondary Antibody/Enzyme (E) E E s s s s s s s s s Substrate Product P P P P P ECL化学发光 * Western Blot western blotting western-bloting(蛋白印迹) 免疫印迹immunoblotting 第二步：将蛋白条带从凝胶中转移到一种固相支持物上（NC膜or PVDF膜），多采用电转（湿法or半干法）。 Western Blotting基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽或蛋白从凝胶转移至一种固相支持物上，然后用这种多肽或蛋白的特异抗体来检测。 western-bloting(蛋白印迹) 免疫印迹immunoblotting 第三步：用特异性抗体检测印迹在膜上的目的蛋白（直接法or 间接法），酶标二抗。 样 品 处 理 电 泳 转 膜 免 疫 反 应 结 果 处 理 水溶液提取法 蛋白提取试剂盒 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙 醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 固相载体 亲和基团配体 BCA法蛋白标准曲线 loading buffer SDS凝胶电泳 SDS 是阴离子去垢剂能破坏蛋白质中的氢键和疏水键，按一定比例（1.4：1,重量单位）和蛋白质疏水区结合成复合物，使蛋白质展开使之带负电荷且量远远超过其本身原有的电荷量，掩盖了各种蛋白质分子间的天然电荷差异；巯基乙醇可以消除形状的影响；蛋白质的迁移率将主要取决于其分子量的大小。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶 原理 O ∥ CH2=CH–C–NH2 O