第二节胚胎工程实验技术(北师大)精要.ppt

一、人工授精和胚胎体外培养 三、胚胎分割 一）胚胎分割技术研究概况 　 胚胎分割技术开始于Nicholas （1942）对大鼠2-细胞卵裂球的分离和培养。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。 　 我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法获得同卵双生小鼠，1987年又获得同卵双生山羊。1986年窦忠英等获得分割胚牛犊，1990年又获得奶牛四分胚后代。1987年谭丽玲等获得同卵双生犊。 二）胚胎分割的基本程序 切割器具的准备； 胚胎的预处理； 胚胎的分割； 分割胚的培养； 分割胚的移植； 1. 切割器具 体视显微镜； 显微操作仪； 胚胎固定管； 胚胎分割针； 2. 胚胎的预处理 用链霉蛋白酶处理 链霉蛋白酶的作用： 使透明带软化、变薄或去除 3. 胚胎的分割方法 酶解法：用链霉蛋白酶处理 机械法：用分割针切开透明带 胚胎分割的基本操作 4. 分割胚的培养； 原因： 早期胚胎切割后发育能力低，一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚，再从输卵管中回收胚胎，最后移植给受体。 方法：体外培养 体内培养（需琼脂包埋） 琼脂包埋的作用 固定胚胎 便于回收 分割胚的移植 要求： 三）胚胎分割技术的应用 应用： 在畜牧方面：扩大优良家畜的数量 在研究方面：培养遗传特性相同的实验动物 性别鉴定 存在问题： 如：早期胚胎细胞的分化和定位的发育机制 不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力 四、胚胎干细胞核移植技术 1. 饲养层细胞培养体系的建立 饲养层培养体系的构成 胚胎成纤维细胞 作用：抑制细胞分化 成纤维细胞（fibroblast）：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核卵圆形，核仁大而明显。 细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。 饲养层细胞（feeder layer ）：在正常机体内，细胞除了获得一些血液来的营养外，还在细胞与细胞之间互换特殊的物质，用于分裂分化和营养等。因而，在细胞体外培养中，除了正常的培养基外，先培养一层特殊的细胞，然后再在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。这些特殊的细胞就是饲养层细胞，通常是成纤维类细胞，这些细胞可以提供实验细胞更好的营养，有的分化研究则是必须有饲养层细胞。 2.胚胎干细胞的获得 时期：囊胚或囊胚期以前 如小鼠：桑椹胚、囊胚 人体：囊胚、原始生殖细胞 培养：置于含饲养层的培养液中培养 方法：原代培养和传代培养 传代培养的作用：抑制胚胎干细胞分化 一）胚胎干细胞核移植程序 饲养层细胞培养体系的建立 胚胎干细胞的获得 胚胎干细胞的核移植 3. 胚胎干细胞的核移植 指把胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物的技术。 二）胚胎干细胞的应用 培养克隆动物的核供体 获得基因敲除动物 治疗性克隆 特点： 后代具有相同的遗传物质，克隆 选择的胚胎： 发育良好的，形态正常的桑椹胚或囊胚 使用的主要仪器： 体视显微镜、显微操作仪、切割刀、切割针 注意: 将内细胞团均等分裂 选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。 胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。 为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。 受精卵 分裂 早期胚胎 胚胎分割基本过程 代孕母牛 植入 植入 分割 胚胎分割的基本过程 胚胎移入培养液 分割胚胎（机械法、酶处理） 移植胚胎给受体 着床产仔 1.概念：（胚胎干细胞）：简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。 2.特点: 1)形态：体积小、细胞核大、核仁明显。 2)功能：具有发育的全能性；是一种高度未分化的细胞，可分化为成年动物体内任何一种组织和器官。 3）应用