蛋白纯化protocol解析.doc

诱导表达 1、挑取含重组质粒的至ml?LB（含）培养基中37过夜培。 2、按1比例稀释过夜菌，一般将μl菌到含ml LB（含）培养基的ml试管中,?37震荡培养至OD6000.4－0.8（最好0.6，大约需hr，双抗大约需hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入诱导至终浓度作为实验组,两组继续震荡培养hr。 4、分别取菌体ml,?离心1000 g × 1 min收获沉淀，用μl　蛋白loading　buffer重悬混匀5、离心1g × 5 min，取上清作为样品,可做SDS等分析。 1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600=0.4-0.8时，用IPTG诱导1-4小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-20 ℃或立即进行步骤2操作。 2) 用Binding Buffer重悬清洗细胞，混匀，离心收集菌体。再加入1/20细胞生长体积的Binding Buffer，将菌体悬浮起来，混匀，冰上超声破碎细胞。 3) 10000 g，4 ℃离心20－30 min。取上清，置于冰上备用或-20度保存。 二、层析 1) 将处理好的NTA树脂装入合适的层析柱，将样品加到NTA层析柱中，流速控制在0.5-1 ml/min左右，收集流出部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。 3) 用大约5倍柱体积的Binding Buffer洗，流速控制在0.5-1 ml/min左右，直到紫外监测数值基本无变化 4) 分别用2－5倍柱体积的梯度Elution Buffer洗脱，咪唑浓度分别为40mM，60mM，80mM，100mM，120mM，500mM。流速控制在0.5-1ml/min左右，收集洗脱液。待清楚纯化条件后，就可只使用2个咪唑梯度纯化。 5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方式是SDS/PAGE分析。 6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。 三、柱材料处理 1）用大约10倍柱体积的Strip Buffer洗，流速1 ml／min。 2）用大约10倍柱体积的ddWater洗，流速1 ml／min。 3）用大约10倍柱体积的Charge Buffer上镍，流速1 ml／min。 4）用大约5倍柱体积的ddWater洗，流速1 ml／min。 5）用大约10倍柱体积的Binding Buffer平衡，流速1 ml／min。 四、附件：溶液配方 Binding Buffer 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 1 M 咪唑 Charge Buffer 50 mM NiSO4（Nicl2） Strip Buffer 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 100 mM EDTA 离子交换层析法 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 ⒈ 离子交换剂预处理和装柱? 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为H+型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 ⒉ 加样与洗脱? 加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。 洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分