布鲁氏菌分子技术要点.ppt

布鲁氏菌 李天森 内容 布鲁氏菌概述 1 布鲁氏菌研究方法 2 本室对布鲁氏菌的防护 3 布鲁氏菌缺失株构建 4 布鲁氏菌病是人畜共患的慢性传染病，也是《中华人民共和国传染病防疫法》规定的乙类传染病。 布鲁氏菌概述 布病危害  野毒株 牛种2308 羊种16M 布鲁氏菌 疫苗株 牛种S19 羊种M5 本地流行株 羊种043等 信号通路 疫苗 检测 布鲁氏菌 胞内生存 疫苗 基因缺失疫苗 致弱疫苗 胞内生存 凋亡 自噬 融合 ？ 检测 试管凝集 虎红平板 试纸条 PCR 抑制剂 WB 信号通路 本室防护 获得基因缺失株 遗传稳定性 检测 同源重组 筛选 电转化 载体 构建 布鲁氏菌基因缺失株构建 构建自杀载体 1.确定基因 例如：牛种布鲁氏菌2308株omp10基因 首先到ncbi（/）查找牛种布鲁氏菌2308株全基因组序列和目的基因omp10的基因序列。 Omp10基因 384bp Omp10基因上臂 Omp10基因下臂 取1000bp左右 取1000bp左右 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 上臂上游 上臂下游 下臂上游 下臂下游 3‘ 5‘ 18bp 卡那抗性替换 2.设计引物 上臂上游与下臂下游加酶切位点。 3.扩增目的基因片段及融合 4.1卡那抗性替换 需要将融合片段连接到pUC19k载体。 得到pUC19k-omp10(同源臂)-kana载体 4.2无痕缺失 将融合片段连接到pMD19-T载体，酶切之后连接到pGEM-7Zf+载体，同时将SacB基因连接到pGEM-7Zf+-omp10载体，作为负筛选标记。 得到pGEM-7Zf+-omp10(同源臂)-SacB载体 5.电转化 将构建成功的载体电转进入布鲁氏菌感受态中。 6.同源重组筛选 pGEM载体 上下臂融合片段 SacB基因 pUC19K载体 上臂 下臂 Kana基因 上臂 下臂 目的片段 上臂 下臂 上臂 下臂 Kana基因 7.传代培养 1 2 15 * *