基因工程实验指导 - 专业实验I.doc

基因工程实验指导书 缩略词表 缩写英文名称中文名称Amp Ampicillin 氨苄青霉素 6-BA 6-Benzylaminopurine 6-苄氨基嘌呤 bp Base pair 碱基对 Carbenicillin 羧苄青霉素 Cef Cephamycin 头孢霉素 CTAB Hexadecyl-trimethyl-ammonium bromide 十六烷基三乙基溴化铵 dNTP Deoxyribonucleioside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸EB Ethidium bromide 溴化乙锭 EDTA Ethylene diamemnettraacetic acid 乙二铵四乙酸 IPTG Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 Kan Kanamycin 卡那霉素 α-naphthaleneacetic acid α-萘乙酸 Nopaline synthase 胭脂合成酶 NPTⅡ Neomycin phosphotransferaseⅡ 新霉素磷酸转移酶OD Optical density 光密度 ORF Open reading frame 开放读码框 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应PVP Polyvinylpyrolidone 聚乙烯吡咯烷酮 Rif Rifampicin 利福平 SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠Str Streptomycin 链霉素 Tris Trishydroxymethylamino methane 三羟甲基氨基甲烷实验一 植物总 DNA 的抽提电泳检测 一 【实验目的了解植物DNA抽提的主要方法掌握快速抽提DNA了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法；了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作实验原理该方法简便、快速，DNA产量高 (纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合 65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。试剂70％乙醇无水乙醇溴化乙锭(EB)TE缓冲液含10 mmo1L Tris和1 mmo1L EDTA，pH 8.0，高压灭菌琼脂糖凝胶 (0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE配成)TAE(Tris-乙酸盐，EDTA)电泳缓冲液50×浓缩贮存液：Tris碱242g；冰醋酸57.1mL；0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 100mL；加600mL蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL，浓盐酸调pH至8.0。10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、15%的Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0、1.0%SDS。 1、仪器设备 离心机、水浴锅、液氮罐、天平、研钵、EP管、微量移液器(20μL、200μL、1000μL)刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、紫外分析仪、数码相机、封口胶带和电源等。 2、材料 植物叶片。 步骤1、适量人取g）叶片，液氮研成粉末，装入离心管中。2、Buffer P1、研钵、研杵到65℃，65 ℃预热。 5 ℃预热Buffer P1Buffer P2，充分混匀，10000g以上离心10分钟。 小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要洗到界面物质，4000rpm离心3-5分钟，收集下液。 加入1.5倍体积的Buffer P3立刻轻柔涡旋，充分混匀。 将上一部所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱加入收集管中)静置1分钟，12,000rpm离心10分钟，倒掉收集管中的废液。 将吸附柱移到新的收集管中并加入7ml漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液。 重复8。 将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心5分钟，尽量出去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 去除吸附柱