免疫组化讲课原理及方法.ppt

免疫组织化学技术的原理及方法 北京友谊医院病理科 黄受方 免疫组织化学技术的原理及其方法 一. 基本知识 二. 基本原理 三. 方法 四. 结果的判断及异常着色原因分析和对策 一、免疫组化技术的基本知识 一、 免疫组化技术的基本知识 免疫组化的基本概念 利用抗原-抗体特异性结合原理检测抗原或抗体一般是用抗体检测抗原 抗原 两个主要属性：免疫原性及特异反应性，蛋白质具有抗原性 抗体 与抗原能特异性结合—生物学结合是免疫球蛋白Ig 免疫球蛋白的化学结构及其模式图 免疫球蛋白根据重链结构命名 IgG(γ), IgA(α)，IgD(δ), IgE(ε), IgM(μ) 五种免疫球蛋白只有两种类 型的轻连，即： Kappa(κ)和Lambda(λ) 每个抗体分子的轻链必须相同；某一单独的抗体分子 决不可能既有κ链又有λ链。这一点在免疫组化的淋巴瘤诊断中十分重要。 免疫球蛋白的化学结构及其模式图 Fc Fab Ag Fc(Fragment crystalline) 是免疫球蛋白的羧基端，意为结晶片段，因其纯化时呈结晶状态而名之，该片段与抗原特异性有关 Fab(Fragment antigen bingding) 该端是抗体与抗原特异性结合的部位，每分子Ig能结合2个抗原分子 多克隆抗体与单克隆抗体及其产生 多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体 单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单株淋巴细胞（克隆）所产生的抗体 多克隆抗体与单克隆抗体及其产生 多克隆抗体的产生 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。在病理诊断中，有利划归肿瘤的基本类型。 常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以RaH（Rabbit against Human）表之。 多克隆抗体亦可产生于羊、猪、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类，对后继抗体的选用至关重要。 多克隆抗体与单克隆抗体及其产生 单克隆抗体的产生 应用细胞融合的杂交瘤技术（Hybridization），以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞（肿瘤性B细胞）融合形成杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限地增殖。将瘤细胞在体外培养或注入小鼠腹腔内而获单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人（抗原）的抗体常以MaH表示，现在亦有兔的单克隆抗体 抗原的制备： 传统用蛋白提纯 近来可应用分子生物学技术：已知抗原的基因结构，用其合成多肽，作为抗原，如ER、PR抗原的制备 现有兔的单抗 多克隆抗体和多克隆抗体的选用 单克隆抗体的制备比多克隆抗体复杂，价格更贵；在应用中不一定比多克隆抗体好。 单克隆抗体的特异性强，多克隆抗体则敏感性高，为何使用完全决定于使用的目的性 市售抗体的种类 某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗体，如α-胰蛋白酶 有些抗体的抗原来自动物，利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。如Desmin来源于鸡的肌肉 近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外，还有兔源性 标记抗体 在抗体上用化学方法联接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到 标记物种类：荧光素：异硫氰酸荧光素或罗丹明 酶：辣根过氧化酶，硷性磷酸酶 金属离子：胶体金颗粒 标记的方法：化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性，从而使染色敏感性降低 酶 — 抗酶抗体复合物 通过免疫反应而不是化学方法，将酶结合到抗体上，形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物（Peroxidase AntiPeroxidase Complex），PAP复合物属非标记性，保护了酶的活性，比免疫荧光法敏感上千倍。 亲和素—生物素复合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ） 亲和素有四个生物素分子特异性结合部位，其结合力强，不可逆，还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体联接第一抗体，另一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于ABC法的免疫组化中 酶标亲和素（Labelled streptavidin） 在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感 多聚物载体 一步法