分子生物学基本技术介绍.pptVIP

实验基本技术 分子生物学部分 存在问题 1. 基本的实验技能 2. 实验习惯 3. 责任感和安全性 核酸纯化技术 离心分离技术 凝胶电泳技术 核酸定量技术 分子杂交技术 序列分析技术 ……………… 一 核酸纯化技术 原理 1. 核酸混合物成分: 结构类-细胞碎片，细胞器，其他 大分子-DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等 小分子-氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等 2. 关键: DNA，RNA—Protein 3. 方案： Protein变性 苯酚：强变性 25 氯仿：弱变性 24 异戊醇：消泡 1 4. 苯酚的处理：重蒸-饱和-pH 重蒸：去除醌类氧化物 饱和：防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合 方法：蒸馏（183℃）-收集（棕色瓶）-饱和与调pH（Tris-HCl pH8.0）-0.1%8羟基喹啉- 4 ℃或-20 ℃保存 方法 样品+等体积饱和苯酚 10kb以上轻柔混匀；10kb以下振荡 离心（12000*g） 取上清 核酸相 Protein变性相 有机相 二 离心技术 原理 离心力：F= ω 2rm RCF=F/G= ω 2r/g =（2π * rpm）2r/g =1.119*10-5(rpm)2r 浮力密度：K=m-mp0/p 沉降阻力：f*(dx/dt) RCF=k+ f*(dx/dt) 差速离心—密度梯度离心 操作 离心机分类：普通 6000rpm 高速 20000-25000rpm 超速 30000-80000rpm 平衡 温度-离心力-转速 转头：角转，平转，垂直转 三 凝胶电泳技术 原理 等电点：DNA pI=6.0-7.0 琼脂糖-PAG：支持介质 U=V/E=（d/t）/（v/l） =Q/(6 π rη) 电泳影响因素 1. DNA物理性质 质粒： CC＞L ＞OC 线形：㏒10M 正比 1/m 2. 介质性质 ㏒10U= ㏒10U0-KrT 分离范围：agrose：100bp-60kb PAG：5-500bp 3. 电压：5v/cm 4. 缓冲液：TAE，TBE，TPE 四 核酸定量技术 原理 A= ㏒10（1/T） = abc 浓度：稀溶液（A-0.05-1.0）+ b=1cm DNA：1OD260=0.05ug/ul RNA：1OD260=0.04ug/ul dsDNA：1OD260=0.033ug/ul 纯度：OD260/OD280=1.6-1.8 五 分子杂交技术 六 序列分析技术 作业 1. 市售苯酚为什么要饱和与重蒸？ 2. 离心操作应该注意哪些问题？ 3. 如果要分离470bp和5kb DNA 应该选择什么凝胶？ 4. 在核DNA定量时，取10uL DNA待测液，用TE buffer 稀释到100uL 后，加入到0.5cm的石英比色皿中。OD260测定为0.21，问DNA待测液的浓度是多少？ 5. 简述DNA序列分析的基本原理。 任 务 采集植物叶片 1. 植物的科, 种, 属 2. 取幼嫩叶片0.8克(中午) 3. 清洗干净, 擦干水分!? * * *